在植物的生长发育过程中,从早期的胚胎发育至后期侧生器官的分化,极性的建立起着重要的作用。随着遗传学和分子生物学技术的发展,人们对植物极性建立分子机理的认识也深入到分子水平。通过对拟南芥侧生器官突变体的研究与分析,人们分离出一系列影响侧生器官背腹面特征的基因。由于在单子叶植物尤其是禾本科植物中所获得的涉及极性建立的突变体较少,因此关于单子叶植物的背腹极性建立的模式研究较少。小麦是主要的禾本科植物之一,同时也是重要的粮食作物,研究其极性建立的机制具有非常重要的意义。本研究从小麦中分离出两个具有YABBY基因保守区域特征的基因,并对其表达模式及功能进行了分析,研究工作为揭示小麦侧生器官背腹极性建立的分子机理提供了重要资料。1. TaFIL与TaCRC基因的分离 分别从小麦的小穗及心皮中分离出YABBY基因家族成员TaFIL(AY330228)与TaCRC(AF545436)。 TaFIL基因的cDNA全长为1216 bp,编码297个氨基酸。TaCRC基因的cDNA全长为1103 bp,编码199个氨基酸。利用NCBI BLAST软件对其序列分析表明,这两个基因编码的氨基酸序列在N端具有zinc finger-like结构域,在C端具有YABBY结构域,是YABBY基因家族成员。TaFIL与TaCRC氨基酸序列分别与拟南芥YABBY基因家族成员FIL和CRC 具有较高的同源性,表明TaFIL与TaCRC分别属于FIL亚家族与CRC亚家族。2. TaFIL与TaCRC的表达模式分析 应用RNA 分子杂交对TaFIL和TaCRC 在小麦不同发育时期器官中的表达进行了分析,杂交结果显示这两个基因具有不同的表达模式。TaFIL在小穗与心皮中表达,在营养器官及颖片和雄蕊中未检测到该基因的杂交信号。TaCRC特异性地在心皮中表达,可能为影响心皮发育的重要基因。3. TaFIL与TaCRC的功能分析为了进一步确定TaFIL和TaCRC的功能,我们构建了35S::TaFIL与 35S::TaCRC 正<WP=10>义表达载体,转化野生型拟南芥。虽然35S::TaFIL与35S::TaCRC转基因植株的表型具有某些相似性,但二者之间有显著的不同。根据表型强弱,35S::TaFIL转基因植株被分为两类。一类转基因植株仅产生两片向背面翻卷的子叶,没有莲座叶的产生。另一类转基因植株可以产生4-5片莲座叶,子叶与莲座叶也显著地向背面翻卷。通过转基因植株子叶与莲座叶叶片的横切面分析,与相同阶段的野生型相比,卷曲的叶片腹面与背面表皮细胞数目的比率升高,表明子叶与莲座叶向背面卷曲可能是由于背腹面细胞数目改变引起。通过扫描电镜分析,35S::TaFIL转基因植株子叶与莲座叶腹面的表皮细胞特征部分地趋向于野生型子叶与莲座叶的背面表皮细胞特征。组织切片分析表明转基因植株叶片的内部组织并没有发生背腹极性的改变。TaFIL基因部分地促进了侧生器官叶片腹面表皮特征背部化。 35S::TaFIL转基因植株的苗端分生组织发生显著的变化。野生型拟南芥的苗端分生组织呈半球型,细胞质浓,而35S::TaFIL转基因植株的苗端分生组织已不具有明显的半球型,细胞排列无规则,且细胞质稀。TaFIL基因的过量表达抑制了苗端分生组织的发育。由此可见,过量表达的TaFIL基因不仅促进侧生器官的背部特征,抑制苗端分生组织的生长,同时也影响叶片背腹面的细胞分裂。在拟南芥中异位表达TaCRC基因引起叶片与心皮表型的改变,在整个心皮发育过程中,转基因植株的心皮比野生型宽且短。同TaFIL转基因植株类似,异位表达TaCRC转基因植株叶片腹面的表皮细胞特征部分地趋向于野生型叶片的背面表皮细胞特征。对TaCRC转基因植株进行Northern鉴定,结果显示,在转基因材料的叶和花中均检测到杂交信号,而在野生型拟南芥中没有检测到相应的信号。4. YABBY家族的基因具有进化上的保守性根据TaFIL与TaCRC基因序列分析、基因表达模式及功能分析,表明TaFIL与TaCRC是YABBY基因家族成员,分别属于FIL亚家族与CRC亚家族成员。在拟南芥中过量表达TaFIL与过量表达FIL的表型非常相似,进一步证明在双子叶植物与单子叶植物的进化过程中,FIL亚家族成员的功能仍然具有很大的保守性。TaCRC在拟南芥中过量表达的表型在一定程度上类似于过量表达CRC的表型,这表明在双子叶植物与单子叶植物中CRC亚家族成员功能也具有进化上的保守性。以上研究结果为研究单子叶植物背腹极性建立的机制提供了一定的资料。