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背景:自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)病因和发病机制尚未完全阐明,对糖皮质激素或者联合硫唑嘌呤治疗有效,最终发展为肝硬化或肝衰竭。AIH患者体内的调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)存在数量及功能缺陷,Treg损伤在AIH中的实际作用仍有争议,但基于Treg的AIH治疗可能仍然有效,过继转移Treg细胞可能是治疗AIH很有前景的方法,如何扩增Treg并发挥免疫调节效应是目前研究的热点。肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)可能在免疫调节中发挥重要作用,在肝移植早期可选择性地扩增同种异体Treg。为了观察HSC对Treg细胞的诱导和扩增作用,探讨Treg细胞过继转移对刀豆球蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导的小鼠AIH的治疗作用,我们设计了本实验。目的:寻找分离培养原代肝星状细胞(HSC)的有效方法,观察异体HSC对Treg细胞的诱导扩增作用,探讨过继转移扩增的Treg细胞对ConA诱导的小鼠自身免疫性肝炎的治疗作用及机制。方法:采用OptiPrep密度梯度分离液对BALB/c雄性小鼠原代肝星状细胞进行原位手工灌注分离培养。倒置荧光显微镜观察HSC自发荧光,油红O染色、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定细胞。用免疫磁珠分选法分离C57BL/6小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞和CD4~+CD25~-Teff细胞,CFSE标记新鲜分离的CD4~+CD25~+Treg细胞,原代(0-HSC)、2代(2-HSC)与新鲜分离的CD4~+CD25~+Treg细胞共培养72小时,流式细胞仪检测Treg的增殖,观察异体HSC对Treg的体外诱导增殖作用。并以不同浓度的HSCs与Tregs(1:1或者1:10)共培养,观察不同浓度的HSCs诱导Tregs的增殖能力。CFSE标记的CD4~+CD25~-效应T细胞(CFSE-Teffs)与Teffs或Tregs在有或无HSCs的情况下共同培养72小时,流式细胞仪检测CFSE-Teffs的增殖,以确定Tregs对Teffs增殖的抑制能力。同样,CFSE标记的Tregs与HSCs在Transwell培养板中共培养,以确定潜在的细胞-细胞接触依赖性,探讨HSC扩增Treg的机制。ConA诱导AIH小鼠模型,过继转移新鲜分离的Treg及体外异体HSC诱导扩增的Treg到AIH小鼠体内,24小时后观察肝脏HE染色的病理变化,血清ALT、AST水平变化,修正的Ishak肝炎活动指数(IMHAI)对肝脏组织学切片进行独立评分,观察脾脏细胞Treg和Th17细胞数及Treg/Th17比值,流式细胞仪微球捕获芯片技术CBA(Cytometric Bead Array,CBA)检测小鼠血清炎症细胞IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10的变化。结果:(1)我们分离出高得率和高纯度的原代肝星状细胞(0-HSC),在倒置显微镜下328nm波长的紫外光激发下自发蓝绿色荧光,油红染色胞浆中脂滴呈红色,细胞核呈蓝色;在传2代培养的HSC(2-HSC)α-SMA、Desmin染色阳性细胞胞浆为棕色颗粒,达100%阳性,全部活化。(2)HSC与Treg共培养72h后,流式细胞仪检测Treg增殖率显示2-HSC诱导的Treg增殖率明显高于0-HSC诱导的Treg。(3)Treg与HSC以1:1的浓度共培养较10:1的浓度共培养Treg的增殖率明显增高,表明HSC诱导Treg的体外增殖是剂量依赖性的。(4)Transwell实验表明,诱导的Treg增殖是由细胞-细胞直接接触引起的,而非HSC分泌的细胞因子作用。(5)与HSC共培养的Treg抑制Teff的增殖比单独培养的Treg抑制Teff增殖的效果更好,诱导增殖的Treg体外发挥明显的免疫抑制功能。(6)ConA尾静脉注射成功制备小鼠AIH模型,模型小鼠肝脏汇管区淋巴细胞、浆细胞浸润和肝细胞坏死明显,肝脏IMHAI评分和血清ALT、AST升高,细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10均明显高于正常,脾脏Treg和Th17的数量增加,Treg/Th17比值明显低于对照组。AIH小鼠体内存在Treg/Th17比值失衡。(7)将诱导增殖的Treg或新鲜分离的Treg过继转移至AIH小鼠24h后,治疗组与模型组相比,肝脏炎症和肝细胞坏死减轻,IMHAI评分和血清ALT、AST水平降低,血清IL-6、TNFα、IFN-γ水平降低,脾脏Treg/Th17比值升高。HSC诱导扩增的Treg治疗效果最为明显。结论:OptiPrep密度梯度分离液分离培养出高纯度高得率的原代肝星状细胞;活化的HSC可通过细胞-细胞直接接触诱导异基因Treg细胞的体外扩增,体外扩增的Treg细胞可发挥对效应性CD4~+CD25~-T细胞免疫抑制功能;Treg/Th17失衡与ConA诱导的自身免疫性肝炎发病有关,过继转移体外异体HSC诱导扩增的Treg可有效改善Treg/Th17的失衡,降低血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平,有效治疗ConA诱导的小鼠自身免疫性肝炎。