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【目的】结核病仍是造成人类死亡的感染性疾病中最常见病因之一。据WHO估计,全球约1/3人口感染了结核分枝杆菌,每年约有八百万新增病例,有二百万人死于结核病。随着艾滋病的流行,形势将更加严峻。我国的结核病疫情相当严重,患病人数之多居世界第二位,是结核病高负担国家之一。控制结核病的关键是尽早发现,隔离和治疗活动性肺结核病人。传统诊断结核病的方法主要有涂片染色、培养、胸片及皮肤结核菌素试验。这些方法已持续使用了几十年,但是它们存在灵敏度低特异性差的缺点,阻碍了结核病的控制。这就迫切要求我们寻求快速、准确并且简便的方法。近年来,分子生物学技术以其快速灵敏的优点而得到迅速发展。在结核病诊断方面,一个主要进展是对分枝杆菌菌种的快速鉴定,主要有Gen-Probe公司的Accuprobe基因探针技术,它明显缩短了细菌鉴定时间,但是该技术必须在培养到分枝杆菌的基础上进行。另一个主要突破是直接从临床标本中检测结核分枝杆菌的核酸扩增技术得到了发展,其中主要有基因探针直接试验(AMTD)、Roche Amplicor结核分枝杆菌PCR试验(Amplicor PCR)、连接酶链反应(LCR)。近来,实时荧光PCR技术以其简单快速的优点被广泛应用于基础科学研究、临床诊断和疾病研究等领域。本研究以其它多种分枝杆菌检测技术结合临床诊断为参照,探讨荧光PCR技术在结核病早期诊断中的应用价值。【材料与方法】540例不同类型临床标本分别用BACTEC MGIT-960系统及罗氏培养基培养,分离得到分枝杆菌分别采用传统生化法、实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)扩增技术及结核分枝杆菌复合群培养鉴定测试方法(Accuprobe)进行菌种鉴定。以Accuprobe为参照方法评价Real-time PCR和传统生化法。153例呼吸道标本分别进行Real-timePCR扩增、结核分枝杆菌复合群直接扩增试验(Amplified Mycobacterium TuberculosisDirect,AMTD)、抗酸染色和MGIT-960培养,培养所得菌株用Accuprobe方法进行菌种鉴定。以培养结合临床诊断作为标准评价AMTD和Real-time PCR。【结果】1.540例不同类型临床标本经MGIT-960培养分离到153株分枝杆菌,初代分离率28.3%,平均检测时间为10.5±3.3天;罗氏培养法分离到104株分枝杆菌,初代分离率19.3%,平均检测时间为26.1±5.6天。2.对153株分枝杆菌进行菌种鉴定,Accuprobe方法检测到结核分枝杆菌127株,检测时间为2小时;Real-time PCR方法检测到结核分枝杆菌127株,检测时间为2小时;传统生化法检测到123株结核分枝杆菌,平均检测时间为28.2±4.8天。与Accuprobe方法相比较,Real-time PCR技术的灵敏度和特异性均为100%。3.153例呼吸道标本Real-time PCR方法直接检测阳性68例,阴性85例:AMTD检测阳性73例,阴性80例;抗酸染色阳性70例,阴性83例;MGIT-960培养分离到77株分枝杆菌,经Accuprobe鉴定结核分枝杆菌69株。与MGIT-960培养结合Accuprobe鉴定结果比较Real-time PCR法和Gen-probe AMTD方法的灵敏度分别为90.8%和94.5%,特异性分别为92.7%和90.5%。4.以培养结合临床资料作为标准,153份临床标本中75例被确认为阳性。MGIT-960培养、Real-time PCR和AMTD方法的灵敏度分别为92.6%、91.5%、和94.9%;特异性分别为100%、100%和97.2%;阳性预测值分别为100%、100%和97.3%;阴性预测值分别为92.1%、90.9%和94.4%。【结论】Real-time PCR方法在分枝杆菌菌种鉴定及直接检测呼吸道标本中结核分枝杆菌均具有快速、灵敏特异的优点。MGIT-960培养结合Real-time PCR鉴定,以及Real-timePCR直接检测呼吸道标本,可以使结核病的诊断显著提前且易于推广应用。