论文部分内容阅读
蛋白质的高选择性识别可以为蛋白质组学研究、疾病诊断和功能化蛋白纯化等提供重要技术基础,是生命科学领域的重要研究内容。近些年,科学家为实现高效分子识别,在研制开发高选择性吸附新材料方面进行了大量工作,其中磁性纳米颗粒因其良好的选择性吸附能力及其广泛的应用前景受到研究者的日益重视。为实现蛋白质选择性吸附,研究者在磁性纳米颗粒表面修饰特定配体（如抗体、核酸适配体等）,但多数方法都比较复杂,步骤多,时间长,且生物配体相对昂贵或难以获得,稳定性和适应性受到限制,影响了其应用拓展。分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology,MIT）制备的人工受体具有选择性识别能力,因其制备成本低、稳定性高、适用范围广,有望成为天然生物配体的替代物。结合磁性纳米颗粒的分离优势和蛋白分子印迹聚合物吸附选择性特性制备的磁性蛋白分子印迹复合物新材料越来越受到关注和重视。开发出制备简单、分离高效的磁性印迹复合物从而实现蛋白选择性吸附具有重要理论意义和应用价值。已有磁性蛋白分子印迹研究中还存在制备过程复杂、磁响应慢、吸附平衡时间长、吸附容量不高、选择性不强等问题。针对上述问题,本论文开展了四类新型磁性蛋白印迹复合物的制备和吸附性能研究。论文内容包括以下五个部分:1.绪论部分简要介绍了分子印迹技术的原理、分类、制备方法及应用,综述了包括磁性印迹材料在内的分子印迹新型功能材料的研究进展;详细分析了蛋白质印迹研究的方法和最新进展。已有研究成果的分析为蛋白质印迹研究提供了必要的基础,也说明蛋白质印迹研究的重要性和意义。2.第二章采用不同方法成功制备磁性Fe3O4纳米颗粒,其中,一步溶剂热法制备得到的羧基修饰磁性Fe3O4纳米颗粒粒径约200 nm,具有良好的水相分散性,饱和磁感应强度达到67.06 emu/g,磁响应强。采用一步功能化法在磁性内核表面实现聚合双键修饰,然后采用利用表面印迹技术,以溶菌酶为模板分子,以丙烯酰胺功能单体,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,形成预聚合体系后再引发自由基聚合,成功制备了新型溶菌酶磁性印迹复合物。制得的磁性印迹复合物颗粒饱和磁感应强度接近40emu/g,能在30 s内实现磁分离,具有较好的磁响应性能。吸附实验表明,溶菌酶磁性印迹复合物颗粒10 min就能达到吸附平衡,具有很快的吸附动力学性能。吸附容量为29.3 mg/g,印迹因子为1.88。吸附动力学数据符合准二级吸附动力学模型;吸附等温线更符合Langmuir模型。吸附选择性实验计算得到对参考蛋白BSA和OVA的选择性因子分别为1.69和1.73,结果表明制备的溶菌酶表面印迹复合物颗粒具有吸附选择性。竞争吸附实验结果表明,在有竞争蛋白存在的条件下,溶菌酶磁性印迹复合物颗粒表现出较好的特异性吸附能力。在实际样品吸附实验中,制备的磁性印迹复合物颗粒能快速选择性吸附鸡蛋清中的溶菌酶。本章采用具有更强磁响应的磁性纳米颗粒作为内核,通过优化表面修饰过程,控制印迹层厚度,制备得到具有便捷、快速磁分离特性和选择性吸附蛋白的能力的磁性印迹复合物颗粒,可以进一步推广应用于生物样品中目标蛋白的选择性磁分离。3.第三章成功制备了羧基修饰磁性Fe3O4纳米颗粒表面直接印迹溶菌酶的新型磁性印迹复合物。利用Fe3O4磁性颗粒表面修饰的羧基与模板蛋白溶菌酶分子直接发生相互作用来约束模板蛋白溶菌酶,然后引入丙烯酰胺印迹单体形成预聚合体系,通过引发自由基聚合形成表面印迹包裹得到具有选择性识别能力的印迹复合物颗粒。制备得到的磁性印迹复合物饱和磁感应强度接近55 emu/g,能实现更快速磁分离,具有更好的磁响应特性。引入具有静电相互作用和氢键作用的羧基可以增强丙烯酰胺印迹体系的蛋白印迹效果。吸附实验表明,得到的磁性印迹复合物能在30 min内达到吸附平衡,具有较好的吸附动力学性能,并符合准二级吸附动力学模型。吸附容量达到52mg/g。吸附等温线数据符合Langmuir模型。吸附选择性实验计算得到对参考蛋白BSA和OVA的选择性因子分别为2.69和2.90,实验结果表现出更好的吸附选择性;竞争吸附实验结果表明制备得到的磁性蛋白印迹复合物对目标蛋白溶菌酶表现出较好的特异性吸附能力。直接利用表面羧基吸附模板蛋白再实现印迹包裹,制备得到的磁性印迹复合物具有更快的磁响应能力,印迹吸附效果得到加强,具有实际应用潜力。4.第四章利用掺杂的方式,将羧基修饰的Fe3O4磁性颗粒引入到sol-gel过程制备磁性蛋白印迹复合物,实现蛋白的选择性吸附。印迹制备以溶菌酶为模板分子,以APTES为功能单体,TEOS为交联剂,将磁性纳米颗粒掺杂进预聚合体系并利用溶胶-凝胶过程制备得到磁性印迹复合物。在这一印迹识别过程中,羧基修饰的磁性纳米颗粒起到双重作用,既作为磁性来源,使得制备的印迹聚合物具有磁响应;又在sol-gel印迹体系中引入静电相互作用,加强印迹吸附效果。制备得到的磁性蛋白印迹复合物的饱和磁感应强度为10.80 emu/g,具有磁分离能力。吸附实验表明,得到的印迹聚合物的吸附动力学性能得到改善,达到吸附平衡只需要30 min;吸附容量达到91.74mg/g,印迹因子高达8.86;与对照蛋白的选择性因子都超过4,表现出非常好的吸附选择性。竞争吸附实验结果表明,在有竞争蛋白存在的条件下,溶菌酶磁性印迹复合物颗粒表现出较好的特异性吸附能力。在实际样品吸附实验中,制备的磁性印迹复合物颗粒能选择性吸附鸡蛋清中的溶菌酶,且表现出较大吸附容量的优点。本章方法制备得到的磁性印迹复合物颗粒具有磁分离特性和较好选择性吸附蛋白的能力,具有很大应用价值。5.第五章利用羧基修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒表面吸附溶菌酶蛋白并采用sol-gel过程实现印迹包裹,成功制备得到磁性蛋白印迹复合物。采用表面印迹技术,通过表面修饰的羧基通过静电相互作用和氢键作用吸附蛋白,然后以APTES为功能单体,TEOS为交联剂,利用sol-gel过程实现印迹包裹,成功制备得到磁性印迹复合物。制备得到的磁性印迹复合颗粒饱和磁感应强度达到43 emu/g,能够实现快速磁分离,具有良好的磁响应。在溶胶-凝胶印迹识别体系中引入静电相互作用和氢键作用可以加强印迹吸附效果。吸附实验表明,磁性蛋白表面印迹复合物在前10 min吸附量就达到平衡吸附量的80%,在30 min内达到吸附平衡,具有较好的吸附动力学性能。吸附容量为43.9 mg/g,印迹因子4.99。吸附选择性实验计算得到对照蛋白的选择性因子都超过4,结果表明制备得到的蛋白表面印迹复合物具有较好的吸附选择性。竞争吸附实验结果显示磁性印迹复合物颗粒对目标蛋白溶菌酶表现出较好的特异性吸附能力。在实际样品吸附实验中,磁性印迹复合物颗粒能选择性吸附鸡蛋清中的溶菌酶。利用本章方法制备得到的磁性印迹复合物颗粒具有快速磁分离特性和较好选择性吸附蛋白的能力,具有很高应用价值。