【摘 要】
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目的:端粒对基因组的稳定性起着重要作用,端粒功能异常与疾病的发生息息相关。包括G四链体在内的高级结构,会引起端粒功能障碍,阻碍端粒酶识别并抑制端粒延长,导致端粒缩短。研究表明,一些小分子配体可以结合并稳定该结构,引起端粒DNA损伤并抑制端粒酶活性,进而抑制癌症的发生。然而,我们发现端粒酶可以修复这些端粒异常。在这里,我们试图回答G4稳定性配体和端粒酶抑制剂的联合应用是否可以诱导长期DNA损伤并抑制
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目的:端粒对基因组的稳定性起着重要作用,端粒功能异常与疾病的发生息息相关。包括G四链体在内的高级结构,会引起端粒功能障碍,阻碍端粒酶识别并抑制端粒延长,导致端粒缩短。研究表明,一些小分子配体可以结合并稳定该结构,引起端粒DNA损伤并抑制端粒酶活性,进而抑制癌症的发生。然而,我们发现端粒酶可以修复这些端粒异常。在这里,我们试图回答G4稳定性配体和端粒酶抑制剂的联合应用是否可以诱导长期DNA损伤并抑制肿瘤生长。方法:(1)在天然化合物数据库中进行基于分子对接的虚拟筛选分析,以鉴定新型G4稳定性配体。通过圆二色光谱和紫外可见光谱的热变性实验进一步证明该配体(大黄素)对G4具有稳定作用。此外,采用IF-FISH的方法进一步证明大黄素对细胞内端粒G4的影响。(2)大黄素处理不同种类的细胞不同时间,采用IF-FISH和中期染色体FISH实验,检测大黄素对基因组DNA损伤和端粒功能的影响;采用TUNEL和SA-β-gal的方法检测大黄素对细胞凋亡和衰老的影响。(3)大黄素处理不同种类的细胞不同时间,采用TRAP和q-RT-PCR的方法检测大黄素对端粒酶活性的影响。(4)通过端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性,再次检测大黄素对端粒酶阳性、端粒酶阴性和无端粒酶活性细胞的细胞增殖的影响以及对端粒功能异常现象的影响。(5)建立异种移植的乳腺癌小鼠模型,使用大黄素和端粒酶抑制剂联合处理小鼠,观察小鼠肿瘤的生长情况,明确联合处理对肿瘤发生的影响。结果:(1)利用基于分子对接的虚拟筛选、圆二色光谱和紫外可见光谱的热变性实验,根据能量值,大黄素被认为是最佳的候选配体之一,具有与G4结合并稳定G4的潜力。IF-FISH结果显示,大黄素可以稳定或诱导细胞内端粒G4的形成。(2)大黄素处理细胞48小时,IF-FISH和中期染色体FISH结果显示,大黄素引起端粒功能紊乱,包括端粒脆性位点、端粒丢失和端粒DNA损伤的增多;TUNEL和SA-β-gal结果显示,细胞凋亡和衰老的数量也明显增加。随着处理时间延长,IF-FISH和中期染色体FISH结果显示,大黄素引起的端粒功能紊乱以及细胞凋亡都得到了明显地恢复。(3)大黄素处理细胞48小时,TRAP和q-RT-PCR的结果显示,端粒酶活性和端粒酶逆转录酶mRNA的表达量明显升高。随着处理时间延长,q-RT-PCR结果显示,端粒酶逆转录酶mRNA的表达量下降。(4)大黄素和端粒酶抑制剂BIBR1532联合应用抑制端粒酶阳性细胞的增殖,但是对端粒酶阴性和无端粒酶活性的正常细胞没有抑制作用。此外,大黄素和端粒酶抑制剂联合应用长期处理细胞,观察到端粒功能异常无法恢复。(5)大黄素和端粒酶抑制剂BIBR1532联合应用处理异种移植的乳腺癌小鼠,观察到乳腺癌小鼠的肿瘤生长受到明显抑制。结论:我们首次发现大黄素诱导的端粒功能异常可以通过增强端粒酶活性,进而导致端粒功能障碍得到修复,削弱其抗癌作用。大黄素与端粒酶抑制剂联合使用可以协同诱导端粒功能障碍,抑制肿瘤的生长,进而为端粒酶阳性癌症的治疗提供新的治疗证据和策略。
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