新型等温核酸扩增技术(IMSA)的建立及其对传染病病原EV71、CVA16、H7N9和HIV-1的快速检测应用

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:youxiing
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传染病是我国发展比较严重的疾病之一,如手足口病、艾滋病以及新近流行的人感染H7N9禽流感等。由于现阶段仍无有效的疫苗和特效药物,对病原的核酸检测成为预防和控制传染病的重要手段。目前,我国推荐传染病病原的核酸检测均是以PCR技术作为平台,但该法在检测上耗时耗力或依赖于昂贵笨重的仪器,不利于在基层检疫或医疗机构中的应用。相比而言,以环介导等温扩增(LAMP)为代表的新方法因检测简单、快速以及高特异性高灵敏性,有着很强的基层应用潜力。然而,LAMP法受到专利的严格保护,导致现有检测试剂盒的实际价格相对偏高,制约了真正应用。于此,本研究发明了一种新型的等温扩增技术即等温多自配引发扩增(IMSA)。本研究基于IMSA技术,分别以实时浊度法和肉眼颜色判定法两种检测方式,建立了对手足口病原EV71和CVA16、人甲型流感H7N9和艾滋病病原HIV-1的快速检测。首先,针对EV71和CVA16的VP1基因、H7N9的H7基因和N9基因以及HIV-1的gag基因的保守序列,分别设计IMSA引物;紧接着,对IMSA的反应条件进行优化;然后,验证IMSA法的检测特异性以排除交叉反应;再就,利用人工构建模板对IMSA法的灵敏度进行评估,并与现有LAMP法进行对比。最后,将所建IMSA法应用到临床样本检测中,以进一步评估检测性能。研究结果表明,优化后的IMSA法具备很强的检测特异性,无交叉反应。在检测灵敏度上IMSA法不仅可媲美现有LAMP法,甚至具备比后者更高的最低检测线。这一结论在临床样本的检测上再次得到验证。同时,本研究详细论述了IMSA法,并探索了不同引物组合的扩增效果。结果显示,IMSA只有六条引物共同使用时才能表现出快速、高特异性高灵敏性的特点。而且,本研究通过产物酶切间接证明了IMSA反应的真实存在。总之,IMSA技术作为一种新型等温扩增技术,一方面打破了LAMP专利在我国的应用限制,另一方面也是对目前核酸体外扩增技术手段的改进和补充。它具备简单、快速、高灵敏性高特异性优势,能为基层传染病防控提供新的技术思路和选择,而且具备向食品安全检测、转基因成分检测以及生态物种保护等领域扩展的潜力。
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