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小鼠的造血和血管系统起源于胚外中胚层。胚胎期6.5-7天时在卵黄囊形成特征性的血岛结构发生向造血和内皮细胞的分化。造血活性由卵黄囊向胎肝的转移标志由单系原始红系造血向多系永久造血的转化。胚胎造血实质是具有不同分化潜能的前体如成血-血管形成细胞、原始红系前体细胞和永久造血多能祖细胞等有序形成的过程。然而，目前对于调控上述前体细胞在哺乳动物胚胎发育中产生、增殖和分化机制的理解依然有限。近年来应用基因敲除小鼠和胚胎干细胞体外分化模型所获得的发现，揭示了某些特异性的生长因子以及转录因子在此过程中发挥的重要作用。大量证据表明： TGF-β家族通过对关键的靶基因的转录水平的调节，调控多种前体细胞的增殖、分化、移行和凋亡。随着SMADS家族的发现，对TGF-β信号传导通路形成了基本的认识。最初的体外实验表明，SMAD2和SMAD3在TGF-β、Activin下游起作用，而SMAD1和SMAD5对BMP信号发生反应。然而，各类SMAD分子在特定的造血前体细胞增殖、分化和活存调控中的角色并不清楚。在多种SMADS中，SMAD5令我们产生兴趣，基于三个原因：1、Smad5基因敲除胚胎中发现卵黄囊的异位造血以及CFU-GM祖细胞数目增加，表明SMAD5可能是早期造血发育的负向调控基因。；2、应用反义核酸封闭Smad5可以逆转TGF-β对祖细胞增殖的抑制效应，表明它可能介导TGF-β信号转导，后者的异常，包括某些SMADS的功能异常，和白血病紧密相关；3、Smad5基因定位在人染色体5q21，此区域的缺失和急性髓系白血病和骨髓增生异常综合症相关，因此，Smad5被怀疑为白血病抑制基因。由于Smad5基因敲除胚胎存在非造血系统的缺陷，可能会影响正常的造血发育，本研究主要选择胚胎干细胞体外分化模型。目的：1，建立高效的胚胎干细胞体外定向造血分化模型。2，利用Smad5基因敲除胚胎和胚胎干细胞探讨其对不同造血前体细胞发育的调控作用。方法：集落形成实验检测不同的造血前体细胞，包括：BL-CFC、HPP-CFC、Ery-P等；流式细胞仪检测造血细胞特异性的表面分子表达；细胞形态学观察；RT-PCR检测造血相关基因在转录水平的表达。结果：1．小鼠胚胎干细胞体外诱导可形成成血-血管细胞（BL-CFC）、原始（primitive）<WP=6>红系前体细胞（Ery-P）、永久（definitive）红系祖细胞（BFU-E/CFU-E）、高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）等多种造血前体细胞；特别是：以6天拟胚体来源的HPP-CFC为对象，重点研究其造血再生潜能。发现ES细胞来源的HPP-CFC的增殖或自我更新特点与卵黄囊相似，而与骨髓不同，因此与拟胚体模拟胚胎造血的结论是吻合的。2．小鼠胚胎干细胞体外分化形成的拟胚体细胞可在照射的免疫缺陷型SCID小鼠体内诱导较低水平的髓系和淋系细胞，但在照射的正常小鼠体内无法形成脾结节（CFU-S）。3．Smad5基因敲除小鼠的卵黄囊（胚胎期9.0-9.5天）HPP-CFC数量和再生能力显著增加。4．Smad5-/-拟胚体中含有的HPP-CFC和CFU-Mix的数目与野生型和杂合型相比增加显著（P<0.01），三种基因型间呈现Smad5基因相关的剂量效应。但是，CFU-GM未发现显著的区别。Smad5基因缺失并不阻止造血细胞的终末分化。RT-PCR发现Smad5-/-拟胚体中对早期造血发育很重要的转录因子SCL和AML1高表达，但对于早期造血祖细胞扩增重要的转录因子GATA2的表达明显下调。Smad5-/-HPP-CFC对低浓度TGF-β1（0.03-0.3ng/ml）的反应显著减弱;而当浓度提高至2 ng/ml时，则被完全抑制。其原因可能是：TGF-β1可通过其它受体激活型Smad分子，如：Smad2或3，来发挥抑制效应。Smad5-/-HPP-CFC的自我更新能力与野生型有显著的差别。首先是数量的差别。其次是次级HPP-CFC细胞形态学的差别。80% Smad5-/-HPP-CFC能产生次级HPP-Mix，而仅有20%的野生型HPP-CFC能产生此类集落。Smad5-/-HPP-CFC的细胞表型和分子表型是吻合的。它含有的转录因子AML1，GATA-2和造血因子受体IL-3、GM-CSF受体的水平显著提高。5．Smad5基因缺失导致BL-CFC数目显著增加（P<0.01）；同时，Smad5基因缺失导致中胚层标记短尾（Brachyury）表达下调，而Flk-1和SCL显著上调。Flk-1和SCL是BL-CFC发育的特征性标记，对中胚层细胞向成血-血管细胞的转变以及后者的扩增和迁移是必要的。三种基因的共同变化表明：Smad5可能介导由中胚层细胞向造血特化的负向调控，并有助于解释成血-血管细胞数量的增加。6．在Smad5缺失的拟胚体中，原始红系造血相关的转录因子GATA-1和EPO受体表达上调以及胚胎型珠蛋白提前表达，后者和Smad5-/-卵黄囊原位杂交的发现吻合。<WP=7>我们证实了TGF-β1对胚胎型珠蛋白βH1和ζ的抑制效应；但此效应在Smad5-/-拟胚体消失，表明至少在转录水平上Smad5介导了TGF-β1对胚胎型珠蛋白合成的抑制作用。相反的是，Smad5缺失导致原始红系祖细胞增殖形成集落的能力减弱。上述结果表明：Smad5可能在原始红系造血的不同方面，即前体细胞增殖形成集落和合成珠蛋白，发挥了不同的作用。结论：小鼠ES细胞体外分化能够重现胚胎早期造血发育的生物学程序；Smad5基因对于胚胎造血发育调控的必要性和多样性，反映了其上游配体TGF-β家族分子在