中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国沿海地区重要的淡水水产养殖品种。近些年来,因为其养殖规模的逐渐扩大,集约化程度的不断提高,所以由病毒、细菌和寄生虫等各种病原引起的疾病日益严重,给中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大的经济损失。颤抖病是中华绒螯蟹病害中最为严重的病害之一,王文等的研究表明颤抖病的病原为一种特殊的新型水产病原——螺原体(Spiroplasma),并将它正式命名为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)。S.eriocheiris是一种无细胞壁、无鞭毛等运动器官的细菌,大约2.0至10.0 μm长。它们能在不具备额外的运动器官的条件下运动非常迅速,在一些黏性介质中的平均游动速度达5μm/s,并且拥有的独特的螺旋形态。运动是病原入侵寄主的重要条件,但是对于S.eriocheirs本身的运动性、运动机制等研究还处在初级阶段。因此,本博士学位论文在前期S.eriocisheir基因组测序的基础上,利用细菌趋化性研究模型实验以及电镜和蛋白质谱等技术,确定了 的趋化性运动行为,对其内部的细胞骨架结构以及成分进行了研究,这些工作为以后研究S.eriocheiris致病机制奠定了良好的基础。1.S.eriocheiris趋化性运动的研究采用毛细管实验、显微琼脂滴实验(Microscopic agar-drop assay:MAA)和细胞捆绑实验研究了S.eriocheiris趋化性行为。通过毛细管实验,发现S.eriocheiris细胞对10 mM甲硫氨酸、20 mM葡萄糖和5 mg/ml卵磷脂具有比较强的趋化性能力。并且当细胞在无氧条件下培养时,这种趋化性能力表现得更为明显。在MAA实验中,通过在一个特制的观察腔室中放置一个含有引诱剂的琼脂滴,再观察和分析这个琼脂滴的周围细胞的行为。实验结果表明:在距离琼脂滴的不同位置细胞数目出现差异,并且形成细胞数目的峰。同时通过细胞捆绑实验,观察了 的趋化性行为。被捆绑的细胞在正常情况下,自由的一端只做随机扭动,当细胞接触引诱剂时,细胞从自由的扭动转变为向前后做反转运动。从这些结果表明:S.eriocheiris具备有感受周围化学物质浓度的能力,并且能够找到最适合的浓度区域。通过对S.基因组的分析发现螺原体缺少大部分具有趋化性系统细菌所具有的双组份系统基因,这可能意味着螺原体具备着一个和现有趋化性细菌不同的趋化性系统或者具有双组份系统,但是其蛋白序列和其他双组份基因存在着很大的差异,然而具备类似的功能。2.S.eriocheiris细胞骨架结构以及成分分析螺原体具备独特的螺旋结构和运动机制,它的这种独特的形态和运动都依赖于内部的细胞骨架。在本研究中,通过去垢剂(Triton X-100)溶解细胞膜和细胞质蛋白后,在螺原体尖端(Tip)发现了一个独特的内部细胞骨架结构。这个骨架结构有一个类似“哑铃”的杆棒状结构和由多条骨架丝组成的带状结构相连。这个“哑铃”结构与肺炎支原体尖端(Tip)内部的杆棒状骨架结构类似。而这带状的骨架结构是由5-9条骨架丝组合而成,相邻的两条骨架丝以极性相反的方式排列,并且从螺旋形细胞的一端到另一端的最短距离路径排列。前期研究结果表明这些带状的骨架丝主要由相对分子质量55kDa的Fibril蛋白组成。通过电镜负染技术观察可知,这个Fibril蛋白形成为宽度为8.1±1.9 nm,长为7.9±2.8 nm以及间距为9.4±1.2 nm四聚体结构单元。通过对获得的骨架丝蛋白进行平均化分析,得到了三种不同的(正方形、椭圆形和圆形)骨架丝结构图。所以螺原体带状的骨架结构可能不是由一种骨架丝构成,由2种或者三种构成。通过肽指纹图谱蛋白鉴定技术,总共鉴定出了 16个蛋白。可以分为四类跨膜蛋白、脂蛋白、丝状蛋白和ATPase活性相关蛋白,与细胞骨架相关的Fibril蛋白和4种MreB蛋白被鉴定出来。综合实验结果表明:Tip结构可能在螺原体的运动方面起到重要的作用,它和后面的骨架条带共同组成螺原体运动的细胞内部发动机。3.S.eriocheiris冷冻电镜相差显微镜观察与运动力学分析本实验通过使用相差显微镜和快速冷冻复制电镜分析了中华绒螯蟹螺原体(S.eriocheiris)和蜜蜂螺原体(Spiroplamsa melliferum)细胞的每个螺旋单位的形态学参数,以及物理学角度提出螺原体的运动过程中的力学参数模型。S.eriocheiris和S.melliferum螺旋结构的长度范围在500 nm至1000 nm之间。细胞螺旋结构长度和螺旋高度从Tip端到后端呈增加趋势,但是细胞直径区别不明显。通过对螺原体的扭结(kink)结构的测量,发现S.eriocheiris和S.melliferum之间kink角度区别不明显,S.eriocheiris大约在127.17± 12.86度,Smelliferum大约在132.45±14.59度,在不同粘度下螺原体运动的速度和kink传输速度不一样。游动速度和kink的传输速度之间呈正比关系,kink传输速度越快,螺原体的运动速度越快。通过实验观察,重新提出了螺原体运动过程中的几个关键因素:(1)螺原体运动的方向和kink传输的方向相反;(2)螺原体运动的速度和kink的传输速度成正比;(3)螺原体的pitch和螺旋高度从Tip端到另一端呈增加趋势;通过对形态学的分析,揭示了螺原体独特的螺旋形细胞形态的内部骨架特征和其运动方式,这为研究螺原体的运动机制奠定了基础。4.秋水仙素作用下S.eriocheiris形态结构和蛋白组学分析在本次试验中,用不同浓度的秋水仙素(0 g/l,1 g/l,3 g/l和5 g/l)加入S.eriocheiris生长的培养基中,然后对形态学、基因表达和蛋白组学方面的改变进行研究。发现在3g/L秋水仙素作用下,S.eriocheiris细胞失去了独特的螺旋形,细胞长度长于对照组。细胞进入平台期所需的时间会随着秋水仙素的浓度升高而延长,S.的致病能力也随着秋水仙素的浓度升高而减弱。运用iTRAQ蛋白定量技术发现在被秋水仙素处理后总共有208差异蛋白包括77个上调蛋白和131个下调蛋白。在上调蛋白中,5个蛋白与能量代谢有关;17个蛋白参与DNA复制和翻译进程;6个蛋白属于转移系统蛋白或者转移酶;11个糖代谢蛋白;11个氨基酸代谢和蛋白质代谢有关蛋白;3个氧化还原酶和23个未知蛋白。在下调蛋白中,12个蛋白是属于核糖体蛋白;7个蛋白参与能量代谢;9个蛋白参与碳化合物代谢;13个蛋白参与氨基酸和蛋白质代谢:18个蛋白参与DNA复制和细胞分裂等过程;2个离子调节蛋白;6个氧化还原酶;13个属于运输系统蛋白或者转移酶;5个脂蛋白和脂类代谢相关蛋白:45个未知蛋白从iTRAQ结果中挑选出,4 个上调蛋白(F0F1 ATP synthase subunit delta,Chromosome partitioning protein ParB,DNABs,Putative NAD(FAD)-dependent dehydrogenase)和 3 个下调蛋白(Cell division protein FtsY,Putative spiralin,NADH oxidase),通过实时定量PCR(qRT-PCR)对其基因表达进行了分析,这7个基因的表达与iTRAQ结果一致。结果表明:秋水仙素可能对螺原体的细胞形态和细胞代谢方面有着强烈的影响。