本文首先对广藿香青枯病菌进行了 PCR鉴定,并利用细菌基因组重复序列PCR(repetitive-element PCR,rep-PCR)指纹图谱分析技术对广藿香青枯病菌进行了遗传多样性分析。在此基础上,选择菌株PRS-84为供试菌株,开展Tn5转座子插入诱变研究,利用反向PCR对突变株Tn5转座子插入位点的侧翼序列进行了扩增,扩增产物经序列测定,再利用生物信息学手段,对突变株Tn5转座子插入位点进行基因功能分析,为筛选有利用价值的突变株奠定基础。1国内外研究评述本章从广藿香的种质资源与鉴定、栽培技术和病害及其防治三方面论述了广藿香的相关研究现状;从青枯菌寄主、生理小种、生化变种及遗传型等方面概述了青枯病菌的遗传多样性研究现状;从Tn5转座子的转座机理、转座子插入位点的鉴定方法及转座子插入诱变在细菌学中的应用等方面综述Tn5转座子的相关研究现状。2广藿香青枯病菌遗传多样性分析本研究在前期研究基础上,利用青枯菌特异性引物OLI1/Y2对分离得到的几十株广藿香青枯病菌疑似菌株进行PCR鉴定,随后观察经鉴定菌株在TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)培养基上的菌落形态;利用rep-PCR指纹图谱分析技术,分别用三组引物(BOXA1R;ERIC1R,ERIC2;REP1R,REP2-1)对广藿香青枯病菌进行遗传多样性分析,结果表明,共有12株广藿香青枯病菌疑似菌株扩增出288bp左右大小的目标条带,以上菌株在TTC培养基上主要呈现6种菌落形态,在80%的相似水平上,BOX-PCR、ERIC-PCR及REP-PCR分别将它们聚类成8,7,7个簇群。由此可知,广藿香青枯病菌具有丰富的遗传多样性,同时在多样性测定方面,BOX-PCR具有更高的分辨率。3 Tn5转座子对广藿香青枯病菌的插入突变及插入位点侧翼序列测定以广藿香青枯菌菌株PRS-84为供试菌株,利用Tn5转座子对其进行插入突变。在含卡那霉素的选择培养基上筛选抗性克隆,分别提取抗性克隆的基因组DNA,用Kanr基因特异性引物P1/P2进行PCR扩增;再用HindⅢ限制性内切酶对阳性克隆基因组DNA进行酶切,酶切产物经T4连接酶连接后作为模板,用引物KAN-2 FP-1/KAN-2RP-1进行反向PCR扩增,随后,扩增产物经引物KAN-2RP-1测序,研究结果表明:经过十几次转座插入突变,得到大量的抗性克隆,经Kanr基因PCR扩增,所得转化子都扩增出663bp大小的目标条带。反向PCR扩增结果,共有538个转化子获得Tn5转座子插入位点的侧翼序列。4广藿香青枯病菌Tn5转座子插入位点的生物信息学分析本研究通过Tn5转座子末端ME序列,找出各突变株反向PCR扩增产物基因序列中的转座子残留序列并将之去除,得到各突变株中Tn5转座子插入位点的侧翼序列;将各侧翼序列在NCBI数据库中进行Blastn相似性比对,找出Tn5转座子插入位点所在基因及其编码产物,并对插入位点所在基因及其编码产物进行分析。同时对Tn5转座子在广藿香青枯病菌基因组DNA中的插入特点进行分析。研究结果表明:不同突变株存在Tn5转座子在同一位点插入的情况或在同一基因不同位点插入的情况,其中核糖体RNA基因较为明显。约有400多个突变株插入失活的基因为结构基因,60多个为调控基因以及40多个为其他基因,其中发现多个突变株的转座子插入位点基因与植物病原菌致病相关的基因有关,其表达产物有葡萄糖抑制分裂型蛋白A、GntR家族转录因子、Ⅱ型分泌系统G蛋白以及LysR家族转录因子等。