坦布苏病毒感染是2010年春季在我国江浙一带出现的一种鸭的新发传染性疾病。该病发生迅速,传播速度快,发病范围广。目前已确定该病毒可以感染多个品种鸭、鹅等。患禽主要症状为:体温升高、四肢无力、瘫痪;产蛋大幅下降;出现头颈震颤等神经症状;排草绿色稀便,气味恶臭。该病感染率可高达90%以上,死亡率在5%~10%。产蛋期鸭产蛋率由90%左右很快降至20%甚至更低。该病严重影响蛋鸭、种鸭的生产性能,危害着我国水禽业的健康发展。坦布苏病毒为正链RNA病毒,病毒粒子直径约50nm,有囊膜,基因组大小为10,990个核苷酸,含有一个长的开放阅读框,其编码的多聚蛋白经水解、剪切、加工后形成3种结构蛋白(衣壳蛋白、膜蛋白前体和囊膜蛋白)和7种非结构蛋白(非结构蛋白1、2A、2B、3、4A、4B和5)。ORF两端分别为3’和5’非编码区,长度分别为94个核苷酸和618个核苷酸。相关研究表明黄病毒属成员非编码区形成的二级结构与病毒的复制、转录和毒力有关。本研究中我们对分离鉴定的两株水禽源坦布苏病毒进行全基因组序列测定与分析;并选取一株鸭源分离株构建感染性克隆和病毒拯救,为研究病毒基因组结构和功能、病毒编码蛋白功能和分子致病机理提供技术支持;利用建立的坦布苏病毒反向遗传操作平台和融合PCR技术,对3’端CS序列和次末端碱基进行了点突变,以探究基因组中两种结构的生物学功能。1.坦布苏病毒Taqman探针实时荧光定量RT-PCR方法的建立根据Genbank公布的TMUV的NS1基因中保守序列设计了一对引物和中间一条Taqman探针,建立了一种适用于TMUV检测的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法标准曲线为y=-2.9227x+42.083,R2=0.9972;特异性强,H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒和鸭圆环病毒等可感染鸭病原核酸模板扩增结果均为阴性;灵敏性高,最低检测敏感度为29 copies/μL。该方法适用于TMUV核酸的快速检测,可应用于空气中、棉拭子样品直接检测,缺点是需要昂贵的仪器设备。2.两株坦布苏病毒的分离鉴定和全基因组测序分析对送检的疑似坦布苏病毒感染的发病鸭、鹅进行了病原的分离和鉴定。参考Genbank中收录的TMUV全基因组序列,设计6对引物引物,结合5’race RT-PCR技术进行了两株tmuv分离株的全基因组序列测定和分析。结果成功分离到1株鸭源(zc株)和1株鹅源(lq株)的tmuv。接种9日龄鸭胚测得eld50分别为10-4.2/ml和10-3.6/ml。动物回归试验显示两株分离株均可引起雏鸭典型的神经症状。全基因组核苷酸序列同源性分析表明,lq株和zc株与sx1株同源关系最近,分别为99.1%和99%。e和ns1蛋白氨基酸同源性分析表明,两株分离株与其他tmuv分离株之间没有明显的遗传变异。亲缘关系最远的fjmh220株、ah2011株和gx2013g株三株tmuv均为番鸭源,tmuv毒株之间是否存在宿主差异性还有待进一步研究。3.坦布苏病毒反向遗传操作的建立根据tmuvzc株全基因组测序结果结合genbank中收录的tmuv全基因组序列以及酶切位点分析,设计了7对引物进行rt-pcr扩增。对低拷贝载体pwsk29进行多克隆位点的改造并命名为pwsk29c。将各段依次克隆至pwsk29c中,在5’末端加入t7启动子序列和taa转录增强子,并引入apai酶切位点;在3’末端加入t7rna酶识别终止序列,在序列上、下游分别引入avrii和noti酶切位点,构建的感染性克隆质粒中(c10495g)位点突变作为分子标签,构建的感染性克隆质粒(命名为pwsk29c-dtmuv)。该质粒经noti酶切线性化后,通过t7体外转录为具有感染性的rna,纯化后转染bhk21细胞,继续培养72h后冻融三次,离心收集上清,对收获的拯救毒株进行鉴定。测序显示结果成功构建了tmuvzc株的感染性克隆质粒,并引入t7转录元件和酶切位点;rt-pcr检测为阳性;间接免疫荧光反应显示其与tmuvmab12b1具有良好的反应性;全基因组序列分析显示,10495位分子标签具有稳定的遗传性;致病性试验显示,拯救株zc1株的eld50为10-3.8/ml,毒力略高于亲本株,拯救株zc1株与亲本株zc株感染雏鸭均出现明显的症状,病毒的一步生长曲线和雏鸭感染后存活曲线也相似。构建的tmuv反向遗传操作为研究tmuv的基因组结构和功能、病毒编码蛋白功能以及分子致病机理等方面的研究提供了技术支持。4.3’非编码区功能的初步研究以构建的zc株感染性克隆质粒pwsk29c-dtmuv为骨架,进行3’端保守序列和次末端碱基的突变,并进行毒株的拯救和鉴定,进而分析3’非编码区部分结构的生物学功能。病毒基因组cdna序列经酶切位点分析在9761位agei限制性酶切位点为单一酶切位点。将cs序列前后片段分别扩增后,采用融合pcr技术进行cs缺失片段的扩增,经双酶切后克隆至pwsk29c-dtmuv中,构建cs序列缺失感染性克隆重组真核表达质粒。首轮进行pcr扩增至tmuv基因组10985位,以扩增产物为模板进行3’次末端点突变片段的扩增,经双酶切克隆至pWSK29C-DTMUV中,构建3’次末端碱基点突变感染性克隆重组真核表达质粒。突变质粒经Not I酶切线性化后,经T7 RNA聚合酶体外转录获得感染性RNA,转染BHK21细胞,继续培养72h,冻融三次离心后收集上清。将收获的病毒液进行鉴定。结果显示,除CS1序列缺失毒株没有成功拯救外,其他毒株均成功拯救。在该位点突变毒株拯救过程中,C→G突变并未显著影响病毒的增殖,而缺失或突变为A、T碱基却使得病毒增殖缓慢。由于未对3’次末端碱基突变株进行序列测定,因此,是否出现了回位突变导致毒株的增殖也有待进一步验证。而CS缺失突变株拯救拯救结果表明,CS1序列在病毒基因组复制过程中具有极为重要的作用,RCS2和RCS3序列的缺失对病毒复制增殖过程具有一定的抑制作用,而CS2和CS3的缺失并不影响病毒的复制增殖,但其缺失突变病毒的毒力是否发生变化也有待进一步研究。