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[目的]将利用生物信息学软件筛选的B群脑膜炎奈瑟菌MC58菌株表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)的优势表位肽,与截短的HBc-N144融合,探究构建的重组表位疫苗HBc-N144-epitope(1+2)通过肌注和滴鼻途径免疫雌性BALB/c小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,尤其是黏膜免疫应答水平及其免疫保护效果,为寻找NspA的功能性抗原表位、研制高效B群流脑表位疫苗提供相关实验依据。[方法]1.构建HBc-N144-epitope(1+2)重组原核表达质粒。通过NCBI查找GenBank中的脑膜炎奈瑟菌MC58标准株,获取NspA的基因序列,运用生物信息学软件预测和筛选NspA的优势抗原片段。将预测的表位的碱基序列插入到截短的乙肝核心蛋白(HBc-N144)免疫显性区域(MIR)的78-79位氨基酸所对应的的碱基序列之间,获得测序正确的重组原核表达质粒pET28a-HBc-N144-epitope(1+2)。2.制备HBc-N144-epitope(1+2)表位疫苗。扩大培养含有pET-28a-HBc-N144-epitope(1+2)融合质粒的E.coli BL21菌株,诱导表达重组蛋白后经镍柱亲和层析纯化,采用Western Blot法对HBc-N144-epitope(1+2)的表达进行鉴定,并通过透射电镜检测病毒样颗粒的形成。3.评价HBc-N144-epitope(1+2)表位疫苗的免疫效果。将纯化后的重组蛋白HBc-N144-epitope(1+2),通过肌注和滴鼻途径免疫3周龄的雌性BALB/C小鼠,采用间接ELISA法检测血清中特异性I gG及其亚类以及生殖道分泌物和肺泡灌洗液中sIgA抗体水平。分离培养小鼠脾淋巴细胞,双抗体夹心ELISA法检测脾细胞上清中IL-4、IFN-γ和IL-17A水平;流式细胞术分析脾淋巴细胞中Th1和Th2细胞亚群。末次免疫两周后,制备致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58菌液,进行小鼠攻击实验,记录HBc-N144-epitope(1+2)表位疫苗的免疫保护率。使用人源补体,进行血清体外杀菌试验,检测免疫小鼠血清抗体的体外杀菌活性。4.观察疫苗接种部位炎症细胞浸润情况。采集肌注组中小鼠接种部位的肌肉组织、滴鼻组小鼠肺组织作H&E染色,分析各蛋白免疫组相应组织的炎性浸润情况。[结果]1.成功构建了HBc-N144-epitope(1+2)病毒样颗粒表位疫苗。经透射电镜检测构建的HBc-N144-epitope(1+2)表位疫苗形成直径为30nm左右的颗粒样结构;2.HBc-N144-epitope(1+2)表位疫苗通过肌注和滴鼻途径免疫小鼠后,能够诱导小鼠产生抗NspA的特异性抗体,并且随着免疫次数增加,抗体水平呈上升趋势。(1)经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope(1+2)组小鼠血清特异性IgG水平明显高于NspA组、HBc-N144组和PBS组(p<0.05);HBc-N144-epitope(1+2)和HBc-N144-NspA组之间无显著差异(p>0.05)。HBc-N144-epitope(1+2)组、HBc-N144-NspA组和NspA组的特异性IgG1/IgG2a比值均大于1。(2)经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope(1+2)组小鼠生殖道分泌液和肺泡灌洗液中特异性sIgA水平明显高于HBc-N144和PBS组(p<0.01),其中HBc-N144-epitope(1+2)组明显高于NspA组(p<0.05),而HBc-N144-epitope(1+2)和HBc-N144-NspA组之间相比较无显著性差异(p>0.05)。(3)流式细胞术检测结果显示肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epito pe(1+2)、HBc-N144-NspA和NspA组诱导的免疫应答均倾向于Th2型。ELISA试剂盒定量检测免疫小鼠脾细胞上清中细胞因子结果显示,经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope(1+2)组和HBc-N144-NspA组脾细胞上清中产生的IL-4、IFN-γ、IL-17A含量均高于Nsp A组(p<0.05),而两组之间相比较无明显差异(p>0.05)。3.HBc-N144-epitope(1+2)表位疫苗具有较好的免疫保护效果:(1)免疫小鼠存活率。肌注法:HBc-N144-epitope(1+2)、HBcN144-NspA和NspA组在致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72h内的存活率分别为90%、90%和80%;HBc-N144和PBS组在48h内的存活率均为0。滴鼻法:HBc-N144-epitope(1+2)、HBc-N144-Nsp A和NspA组在72h内的存活率分别为85%、85%和70%;HBc-N144和PBS组在48h内的存活率均为0。(2)补体介导的免疫血清体外杀菌活性。肌注法:HBc-N144-epit ope(1+2)、HBc-N144-NspA和NspA组在第42d血清杀菌抗体滴度分别为1:16、1:16和1:8,其中HBc-N144-epitope(1+2)组末次免疫后一个月加强免疫获得的血清杀菌抗体滴度可达1:32;滴鼻法:HBc-N144-epitope(1+2)、HBc-N144-NspA和NspA组在第42d分别为1:8、1:8和1:4;HBc-N144-epitope(1+2)组加强免疫后的血清杀菌抗体滴度可达1:16。病理切片结果显示,肌注法中,与PBS组相比,HBc-N144-epit ope(1+2)、HBc-N144-NspA、NspA及HBc-N144蛋白免疫组小鼠肌肉组织均无明显的炎性细胞浸润;滴鼻法中,与PBS组相比,HBcN144-epitope(1+2)、HBc-N144-NspA、NspA及HBc-N14蛋白免疫组小鼠肺组织呈现散在少量炎性细胞浸润。[结论]1.构建的B群脑膜炎奈瑟菌表位嵌合疫苗HBc-N144-epitope(1+2)具有良好的免疫原性,经肌注和滴鼻免疫均可以诱导小鼠产生较高水平的细胞免疫和体液免疫应答(包括黏膜免疫应答)。2.HBc-N144-epitope(1+2)表位嵌合疫苗对MC58感染的实验小鼠有较强的免疫保护作用,免疫血清体外杀菌活性和实验小鼠存活率均高于NspA组。