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目的黑色素瘤因其恶性程度极高而成为皮肤恶性肿瘤致死的主要原因之一,高发的侵袭和转移是其最为显著的特征和影响患者生存的首要因素。黑色素瘤的发病主要与紫外线的过度照射、环境因素、遗传因素、外界刺激等因素相关,目前治疗的主要方式包括手术、化疗、放疗和药物治疗,但预后较差,复发率高,病死率高。肿瘤细胞的无限生长和机体抗肿瘤免疫应答之间的相互作用是影响肿瘤发生发展的主要原因,为了有效激活机体抗肿瘤免疫应答,肿瘤免疫治疗得到了广泛的关注和迅速发展。研究发现,黑色素瘤免疫原性高,通过对其进行免疫治疗,增强机体抗肿瘤免疫应答,能有效的抑制肿瘤的生长,这也使得黑色素瘤的免疫治疗得到迅速的发展。Pim-3作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶,在多种癌症中异常表达增加,主要通过磷酸化特异性底物使其失去活性,导致细胞凋亡减少、增殖增多,最终调控肿瘤的发生发展,因此Pim-3可能成为抗肿瘤治疗的一个新靶点。基于以上背景,我们尝试一方面利用具有免疫刺激作用的单链RNA(ssRNA)序列激活机体TLR-7受体,进而诱导细胞因子的产生,活化免疫效应细胞,最终刺激机体抗肿瘤免疫应答,引起机体免疫系统对癌细胞的自主杀伤及清除;另一方面我们通过RNA干扰技术特异性沉默原癌基因Pim-3的表达,进而诱导肿瘤细胞凋亡,从肿瘤细胞本身出发抑制肿瘤的生长。结合以上两方面的设想,我们构建了靶向沉默Pim-3的双功能shRNA表达载体,该载体既能通过其包含的ssRNA片段活化TLR7受体激发机体抗肿瘤免疫应答,又能通过shRNA特异性沉默原癌基因Pim-3的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。本研究旨在观察此双功能表达载体对小鼠黑色素瘤的治疗作用,并探讨其可能的分子机制。方法1.以小鼠的黑色素瘤细胞系B16为主要研究对象,首先通过Western-blot检测Pim-3在B16细胞、黑色素瘤组织及正常小鼠皮肤组织中的表达。2.用脂质体将 pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA 质粒转染到B16细胞中,通过qPCR和Western-blot等方法检测双功能载体对Pim-3的沉默效果;通过ELISA检测转染后B16细胞中I型干扰素的分泌,以确定TLR信号通路的活化。3.用脂质体转染 pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA 质粒到B16细胞中,24h后,通过AnnexinV/PI染色和TUNEL免疫荧光技术检测B16 细胞的凋亡;通过 Western-blot 等方法检测 Bad、p-Bad、BCL-2、BCL-XL等凋亡相关分子的表达。4.通过划痕、transwell实验检测B16细胞转移和侵袭的变化;通过qPCR和Western-blot技术检测EMT相关指标的变化。5.通过Western-blot检测STAT3、MAPK及NF-κB信号通路的活化情况,通过免疫共沉淀技术(Co-IP)检测Pim-3与STAT3之间的结合,以探讨Pim-3调控B16细胞侵袭转移的机制。6.对C57BL/6小鼠进行B16细胞皮下荷瘤,待肿瘤长出后给予双功能载体治疗,观察肿瘤生长情况,脾脏和肿瘤组织中各淋巴细胞的比例和活化情况。7.给 B16 细胞转染 pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA 质粒后,通过尾静脉注射转染不同质粒的B16细胞,建立黑色素瘤肺转移模型,观察不同载体治疗对B16黑色素瘤细胞肺转移的影响。8.用清除抗体分别对C57BL/6小鼠NK、CD8+T和pDC细胞进行清除,再对小鼠进行B16细胞皮下荷瘤,观察在双功能载体介导的抗肿瘤作用中,这三种细胞所发挥的作用。9.进一步观察pDC细胞清除后,双功能载体的抗肿瘤作用及NK、CD8+T细胞的活化情况。结果1.Pim-3在正常小鼠皮肤中的表达极低,而在黑色素瘤细胞系中明显高表达。2.双功能载体能有效沉默黑色素瘤细胞中Pim-3的表达,刺激Ⅰ型干扰素的分泌,引起TLR信号通路的活化。3.用 Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA 载体转染 B16 细胞后,B16 细胞的凋亡明显增加。凋亡相关分子p-Bad、Bcl-2、Bcl-xl的表达明显下调。4.Pim-3-shRNA,尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表达质粒,能明显的抑制B16的转移侵袭;进一步研究发现Pim-3的沉默主要通过抑制肿瘤细胞EMT过程的发生进而抑制肿瘤细胞的转移侵袭过程。5.ssRNA 和 ssRNA-Pim-3-shRNA 促进 NF-κB 信号通路的活化,而 Pim-3-shRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA沉默Pim-3抑制STAT3的磷酸化,且Co-IP结果显示Pim-3和STAT3之间有明显的结合。进一步研究发现沉默Pim-3可抑制STAT3的磷酸化,进而减弱EMT过程,抑制肿瘤的转移侵袭。6.双功能载体可以显著抑制B16皮下肿瘤的生长,同时能够增加脾脏和肿瘤局部淋巴细胞中NK细胞和CD8+T细胞的比例和活化,并且增加pDC的比例。7.清除NK和CD8+T细胞均可明显削弱双功能载体治疗对黑色素瘤生长的抑制作用。8.清除pDC细胞明显削弱双功能载体对黑色素瘤的治疗作用,NK、CD8+T细胞的比例和活化也减弱。9.Pim-3-shRNA,尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表达质粒,能明显抑制黑色素瘤的肺转移过程。结论1.靶向Pim-3的双功能载体可以明显促进黑色素瘤细胞的凋亡、抑制黑色素瘤细胞的增殖,并引起pDC的活化,分泌大量Ⅰ型干扰素,增强NK细胞和CD8+T细胞杀伤的敏感性,最终有效抑制肿瘤生长。2.Pim-3能够通过增强STAT3的磷酸化而促进黑色素瘤的EMT进程,最终促进黑色素瘤细胞侵袭转移。3.这种兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的双功能载体,具有在沉默Pim-3的同时提高机体免疫应答能力,进而抑制肿瘤的生长、转移侵袭,有望成为用于黑色素瘤等肿瘤治疗的新手段,将为黑色素瘤的治疗提供新的策略和思路。