骨缺损的治疗是骨科基础研究与临床治疗的重要研究方向。骨组织工程学的发展,为骨缺损的治疗开辟了一个新的领域。骨组织工程学的研究内容主要包含种子细胞、支架材料和生物活性因子三个要素。生物活性因子在促使细胞增殖并诱导其分化方面具有重要作用。骨形态发生蛋白(BMP)是一类具有高效成骨诱导活性的蛋白质,在骨组织工程的实验研究和临床应用中都取得了很好的效果。目前常用的BMPs生产方法有真核表达和原核表达两种。真核表达产物活性高,然而生产成本甚高,使其产品无法在临床推广应用。原核表达产物为无活性的包涵体,须经过复性成为正确折叠的二聚体才具有生物活性,但是复性工艺较为复杂,复性效率较低,活性不够稳定。采用特殊生产工艺后,原核表达BMPs生物活性有了较大提高,但在此过程中,生产成本迅速提高,而且在临床应用中,BMPs只有达到一定量后方能发挥成骨作用(毫克级),明显增加了病人的负担,不利于在临床大规模推广应用。因此寻找和研制具有稳定、高效成骨诱导活性,并且廉价的生物分子作为BMPs的替代物,成为矫形外科学领域的一个重要研究方向。LMPs是近年来研究发现的具有成骨诱导活性的细胞内蛋白,其成骨诱导活性甚至优于BMPs。通过对LMPs三种差异剪接体一级结构分析发现,LMP1(1-133AA)是成骨诱导活性所必需的序列。本研究将蛋白转导作用域和LMP1(1-133AA)进行融合表达,利用蛋白转导作用域能将和其融合表达的蛋白分子转入细胞内的特点,将LMP1(1-133AA)转入细胞内发挥生物学活性,以期获得一种新的、具有高效成骨诱导活性的新型融合蛋白。一、LMP1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达根据LMP1基因序列设计、合成引物。采用Trizol法提取MG63成骨肉瘤细胞总RNA,进行RT-PCR,获得LMP1cDNA并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,获得pEGFP-N3-LMP1真核表达载体。将该载体转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察发现pEGFP-N3-LMP1质粒转染HEK293后产生荧光仅存在于胞浆中,而对照组则弥漫于整个细胞内,说明LMP1蛋白仅在胞浆内表达,应该是一种在胞浆内发挥生物活性的蛋白。二、截短型LMP1(tLMP)真核表达载体的构建及其活性鉴定根据LMP1的1-133氨基酸序列是其成骨活性所必需的特点,设计并构建了截短型LMP1(tLMP)真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A-tLMP,tLMP序列中删除了LMP-1基因序列中羧基末端的LIM作用域基因序列。将该真核表达载体体外转染骨髓基质细胞并使用G418筛选。分别在筛选后第6、10和14d终止培养,收集细胞,提取总RNA进行半定量RT-PCR,结果发现转染后骨髓基质细胞tLMP mRNA表达明显增强。通过对转染后骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的检测以及钙结节染色,证实了转染该真核表达载体可以促进成骨特异性基因的表达,并促进骨髓基质细胞向成骨方向分化。通过对转染后骨髓基质细胞BMP2 mRNA水平的检测,发现转染后BMP2 mRNA表达水平有了显著升高,证实了tLMP可以促进内源性细胞因子分泌,从而增强其成骨诱导活性。通过以上实验,成功证实了截短型LMP具有类似于全长LMP-1功能,在体外可以促进骨组织特异性基因的表达,促进成骨,并促进骨髓基质细胞分泌具有成骨活性的细胞因子,为下一步研究奠定了基础。三、蛋白转导技术平台的建立PTD可以将与之融合表达的蛋白质转入细胞内从而发挥该蛋白质的生物活性。为了将tLMP转入细胞内发挥其成骨诱导活性,本实验构建了含有PTD序列的原核表达载体。在选择PTD序列时,我们采用了近年来研究较多的TAT序列。在具体操作过程中,以pET28a原核表达载体为原始载体,根据TAT氨基酸序列,设计了适合于在原核细胞中表达的基因序列,并引入纯化标签和酶切位点,最终成功获得了pET28a-TAT原核表达载体。为了验证pET28a-TAT原核表达载体表达能力以及TAT的蛋白转导功能,我们选择了将TAT和增强型绿色荧光蛋白融合表达,并检测了TAT的蛋白转导能力。本研究通过基因重组技术构建了TAT-EGFP原核表达载体,将该载体转染宿主菌ER2566,并进行诱导表达、纯化后,获得TAT-EGFP融合蛋白。将该融合蛋白和骨髓基质细胞共孵育5分钟后,在荧光显微镜下可见到细胞内有明显荧光,从而证实了TAT可以将与之融合表达的蛋白迅速转入细胞内,为下一步的实验构建了技术平台。四、截短型LMP1融合蛋白原核表达载体构建和蛋白表达、纯化根据人LMP1的1-133氨基酸序列,使用Vector NTI软件对其进行反翻译,获得适合于在大肠杆菌中表达的基因序列。根据该序列设计引物,PCR后获得该基因序列片段。将该片段和pET28a-TAT载体重组后获得重组原核表达质粒pET28a-TAT-tLMP。将测序正确的pET28a-TAT-tLMP原核表达质粒转化大肠杆菌BLR(DE3)表达菌株感受态细菌,挑取克隆进行诱导表达。采用分子生物学专业分析软件Vector NTI对融合蛋白分子进行分子特性分析和预测,并根据其分子特点设计纯化方案。在纯化过程中,利用pET28a-TAT-tLMP载体表达后产生的蛋白多数以包涵体形式存在的特点,首先对其细菌裂解后纯化了包涵体。将包涵体纯化后,用含8M尿素的变性液溶解包涵体,分别进行了亲和层析和离子交换层析两步纯化,获得了纯度较高的蛋白。五、TAT-tLMP融合蛋白体内外成骨活性的研究首先在体外实验中分别检测了融合蛋白对骨髓基质细胞增殖、碱性磷酸酶活性以及钙结节形成的影响,并通过动物实验检测了以纤维蛋白胶复合LMP-PTD融合蛋白的复合材料诱导异位成骨的能力。通过MTT法检测发现融合蛋白对MSCs的增殖无明显影响。实验组细胞的ALP活性均显著高于空白对照组,但要明显弱于rhBMP2。细胞经诱导14d后,进行碱性磷酸酶染色。染色后可见,实验组和诱导对照组培养孔中均呈现深紫色,空白对照组偶见紫色着色。培养至14d时的细胞经Von Kossa染色后,大体观察可见,实验组和诱导对照组培养孔中均呈现黑色,实验组着色较诱导对照组浅,空白对照组培养孔中无黑色沉积。显微镜下可见,细胞呈复层生长,在集落生长的细胞团中央区有黑色团块状磷酸盐沉积。体内实验结果发现,将该融合蛋白和纤维蛋白胶复合后未能在小鼠肌袋内诱导异位成骨。六、Smurf1 WW结合位点多肽成骨诱导作用的研究LMPs独特序列中具有和Smurf1 WW作用域相结合的多肽序列。人工合成的该结合位点多肽可以竞争性拮抗LMP1、Smad1、Smad5与Smurf1的结合。在该部分实验中我们合成了具有PTD作用域的该作用位点多肽,体内外实验对其成骨作用进行了检测。具体方法同第五部分实验。结果发现,多肽对MSCs的增殖无明显影响,并能增强骨髓基质细胞的ALP活性、促进钙结节形成。但是在该多肽和生物蛋白胶复合的条件同样未能见到诱导异位成骨。结论:1、LMP1是一种胞浆内蛋白,其截短型tLMP具有和全长LMP1一样的功能,具有成骨诱导活性;2、TAT是一种高效的蛋白转导作用域,可以将与之融合表达的蛋白质转入细胞内发挥生物学活性;3、TAT-tLMP融合蛋白具有成骨诱导活性,但作用比rhBMP2要弱,两者有一定的协同作用;4、Smurf1 WW结合位点多肽具有成骨诱导活性,但其作用也比rhBMP2要弱,两者同样具有一定的协同作用;5、在使用生物蛋白胶作为载体的条件下,TAT-tLMP融合蛋白和Smurf1 WW结合位点多肽未能诱导异位成骨。