近年来,我国农田土壤镉污染问题越来越普遍。土壤镉污染不仅严重威胁植物生长发育,还可以通过食物链进入人体,危害人体健康。因此,保障镉污染土壤的农业安全生产,并利用超积累植物修复镉污染土壤具有十分重要的现实意义和应用前景。油菜作为我国重要的油料作物之一,具有悠久的栽培历史和广泛的种植面积,对社会经济发展的发展起着重要作用。本文拟选用生物量较大的油菜种质资源,利用它们自身的遗传特性,筛选获得镉高积累和镉低积累油菜品种,然后分析品种间根系形态及地上部生物量和镉含量、地上部镉运输能力、根和地上部镉累积能力、光合系统、氧化损伤程度、抗氧化物含量、抗氧化酶活性,并通过基因组重测序分析、转录组学和qRT-PCR分析,以筛选造成这两种基因型在响应镉胁迫下的差异的关键功能基因BnNramp。随后,通过转基因植物及酵母功能互补分析,从而阐明镉转运蛋白BnNramp基因在油菜体内运输镉由根部向地上部运输中的关键作用。现将主要结论简要陈述如下:1.高、低镉积累油菜品种的筛选及鉴定本研究以39个甘蓝型油菜（Brassica napus）自交系品种为供试材料,利用水培试验,分别取2.5和5μM镉处理10天的地上部进行生物量和镉含量分析。镉处理为2.5μM时,39个甘蓝型油菜的地上部生物量在0.047-1.247 g plant^-11 DW范围内,地上部Cd含量为17.854-276.601 mg kg^-11 DW。镉处理为5μM时,39个甘蓝型油菜的地上部生物量在0.025-0.837 g plant^-1 DW范围内,地上部Cd含量为36.323-359.284 mg kg^-1 DW。通过聚类分析,以地上部生物量和地上部分镉含量作为综合筛选指标,初步筛选出P78为镉高累积基因型,P72为镉低累积基因型。P78和P72在2.5μM镉处理下地上部镉含量分别为100.724和18.419 mg kg^-1 DW,在5μM镉处理下地上部镉含量分别为139.792和46.350 mg kg^-1,但是两个品种的生物量基本一致,说明P78和P72在响应镉毒害的耐受能力方面差异较大。2.高、低镉积累油菜品种的进一步确定及其响应镉胁迫的生理反应以前的研究表明P78和P72在盆栽条件下也为高低镉积累油菜品种,因此。我们筛选P78和P72作为我们的供试材料。在镉胁迫下,高镉积累油菜品种P78和低镉积累油菜品种P72受到镉的毒害程度是一致的,主要表现为P78和P72的根和地上部生物量、根表面积、根体积和根直径在镉胁迫下没有差异。但P78根和地上部的镉含量远高于P72,特别是在地上部。在2.5、5和10μM镉胁迫下,P78的镉含量分别是P72的4.5倍、2.9倍和1.7倍。P78的转移系数（TF值）显著高于P72,尤其是在较低的镉水平下。另外,P78中的生物富集系数（BCF值）也高于P72中的BCF。P72和P78之间BCF_{Root/Solution}的差异随着镉浓度的增加而降低,且在10μM镉处理时没有差异。但是在低镉处理,特别是2.5μM镉处理条件下,P78和P72之间的BCF_{Shoot/Solution}差异显著。即P78具有更强的从根到茎转运镉的能力,以及更强的地上部镉积累能力。其它金属元素含量的测定显示,其它金属元素的吸收也受到镉胁迫的影响,尤其是铁。锌、镁和铜。镉的添加抑制了根对镁和锌的吸收,促进了对铁和铜的吸收。因此,从根系向地上部运输镉的能力角度来讲,P78为镉高富集油菜品种,而P72为低积累品种。光合性能指标测定显示,镉处理后两个品种的光合性能下降,且两个品种之间出现了显著差异,但镉胁迫下细胞间CO₂浓度（Ci）微弱增加。P78中叶绿素含量,净CO₂同化（Pn）和水分利用效率（WUE）的变化均低于P72。抗氧化系统检测显示,P78和P72之间的MDA含量没有差异,并且与正常条件相比,MDA含量不受镉水平的影响,即P78和P72均未发生更严重的脂质过氧化反应。而P72中的H₂O₂含量高于P78,且随着镉处理浓度的增加而升高,即P72是一种比P78更敏感的基因型。但P72中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗环血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性较高,P72受镉胁迫后自身会产生更多的生理反应来抵抗镉的胁迫。然而,在镉胁迫下高镉积累品种油菜品种P78中SOD活性远远高于P72,尤其是在高浓度镉处理时。这进一步说明P78具有更强的响应镉毒害的能力。3.高、低镉积累油菜品种在镉胁迫条件下的基因组重测序数据分析和转录组的差异比较分析通过对600份油菜品种的全基因组重测序数据分析,我们发现甘蓝型油菜基因组中水平上共鉴定到5290000个单个苷酸多态性位点（SNPs）和1310000个插入/缺失（InDels）位点。而P78的19条染色体中鉴定出4589407个SNPs,P72的19条染色体上鉴定出4280658个SNPs。通过对多个已报道的镉吸收和运输相关功能基因家族的SNPs位点差异分析,我们获得了一系列相关的SNPs位点信息。比如,在P78和P72之间鉴定出BnNRAMP基因家族成员存在SNPs的差异。家族成员BnNRAMP1;4,BnNRAMP1;5,BnNRAMP2;1,BnNRAMP2;3,BnNRAMP2;4和BnNRAMP3;1在P78和P72之间有1到4个碱基突变。对存在差异SNPs的BnNRAMPs编码的氨基酸序列分析,显示在编码序列区域中是相同的,即翻译出的蛋白质是相同的。这说明BnNramp基因家族在两个品种之间不存在序列差异。通过数字基因表达谱测序,在去除低质量和含有衔接子和poly-N的序列后,每个样品保留了超过2400万个clean reads,其中超过90%被比对到甘蓝型油菜基因组。在P78和P72的根和地上部分别鉴定出19892和26987个差异表达基因（DEGs）。在所有DEG中,根中上调基因有9537个,下调基因有10355个;地上部上调基因有10616个,下调基因有16371个。并且有10174个基因在根和地上部共表达。它们主要参与镉的吸收、转运和分配、抗氧化系统和其它金属元素的吸收、转运等。GO富集分析使我们能够确定P78和P72之间DEGs的主要分为三类:生物过程（BP）,细胞成分（CC）和分子功能（MF）。无论根或地上部,细胞过程、代谢过程和单一生物过程是生物过程中富集最强的GO途径;细胞成分中最强的是细胞、细胞部分和膜;而绑定,催化活性和转运蛋白活性是分子功能中最丰富三个类别。为了进一步了解DEG之间的分子相互作用,我们进行了KEGG分析。在镉胁迫下P78和P72之间,根中代谢途径最丰富,而植物激素信号转导在地上部富集最明显。此外,膜转运的在根和地上部都有富集。我们发现,在镉胁迫条件下,BnNramp基因家族在P78和P72品种之间表现出显著的差异变化,这与其他的中微量元素转运蛋白家族的表达量差异情况不同。因此,我们推测,BnNramp基因家族可能对于P78和P72在镉由根系向地上部运输中起到重要作用。4.甘蓝型油菜NRAMP基因家族的分析和功能鉴定通过对BnNramp基因家族序列进化树分析和基因结构分析,我们对18个BnNRAMP在油菜中的组织表达特异性情况和在镉胁迫下两个油菜品种中的基因表达情况进行了分析,从而筛选出在P78中表达量较大而P72中较小,且在镉胁迫条件下显著上调的BnNramp2;1和BnNramp4;2作为候选基因。分别对其进行酵母和拟南芥的异源表达,试验结果表明BnNramp2;1和BnNramp4;2可成功互补液泡膜镉转运蛋白YCF1的功能。并且当BnNramp2;1和BnNramp4;2在拟南芥atnramp2或atnramp4突变体和野生型中表达时,转基因株系对镉的敏感性完全恢复到野生型水平甚至优于野生型,并且转基因株系的TF值显著高于拟南芥突变体的。这说明BnNramp2;1和BnNramp4;2是造成P78和P72间镉由根部向地上部运输差异的主要功能基因。本研究筛选和鉴定了镉累积高效品种P78和低效品种P72。随后,通过表型分析、生理指标分析、基因组学和转录组学分析、功能基因鉴定和功能分析等阐明了镉累积高效和低效品种在响应镉由根部向地上部运输差异的主要机制。该工作为进一步阐明油菜累积重金属镉的作用机制提供了重要理论支撑,为以油菜为材料进行农田镉污染的植物修复技术提供了重要的途径。