目的:肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。根据病理分型,肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。肺癌的发生与吸烟、职业暴露、空气污染及肺部感染性疾病有关,但确切的机制尚不明确。因此,了解肺癌的发病机制对于疾病的早期诊断具有重要意义。研究表明在肺癌发生发展过程中,肺癌细胞对于氧化应激呈现出“两面性”,一方面在肺癌发生的早期,氧化应激可以诱导肺癌的发生,促进细胞的增殖;另一方面在肺癌的进展期,肺癌细胞则表现出很强的抗氧化应激能力,进而抵抗细胞凋亡及对化疗药物产生耐药性。因此探讨肺癌细胞对氧化应激刺激的抵抗效应有助于了解肺癌的恶性进程以及对放化疗抵抗的机制。前期工作中发现,肺癌细胞高表达S100家族蛋白——S100A16,且与肺癌细胞转移入脑后的生存活力相关。S100家族蛋白是应激蛋白,有文献报道其参与急性及慢性炎症应激反应,而且与诸多肿瘤的发生、发展密切相关。作为S100家族的一员,有关S100A16的研究是有限的,有研究表明,在乳腺癌细胞中,S100A16可以上调Notch1,ZEB1,ZEB2的表达,诱导乳腺癌细胞发生上皮细胞间质化改变,促进乳腺癌的侵袭和转移;在胶质瘤细胞的细胞质中S100A16可以感知细胞内Ca²⁺信号的变化,从细胞核内进入细胞质参与细胞骨架结构的重构;S100A16可以在肺腺癌细胞膜上表达,其表达水平与肺腺癌的预后相关。这些研究结果提示S100A16具有功能的多样性,其功能的发挥与其在细胞内的定位密切相关。本研究以S100A16为研究对象,探讨在氧化应激条件下S100A16在肺癌细胞内的表达及细胞内蛋白质定位的转变,以及这种转变对肺癌细胞生物学表型的影响。我们试图探明S100A16介导的保护性机制如何帮助肺癌细胞抵抗氧化应激的损伤及可能的机制,为阐明肺癌的发生发展机制具有一定的研究价值。研究方法:1.Western blot检测不同病理类型的肿瘤细胞中S100A16蛋白表达情况。2.给予过氧化氢（H₂O₂）刺激,分析氧化应激条件下肺癌细胞NCI-H446及A549细胞内S100A16表达变化情况。3.利用细胞组分分离试剂盒,对NCI-H446细胞及A549细胞进行不同细胞组分分离（细胞质和细胞核）利用western blot分析不同组分中S100A16的表达情况;免疫荧光后用激光共聚焦显微镜观察氧化应激条件下S100A16在细胞内定位情况;利用双重免疫荧光染色,观察S100A16与细胞核仁标志分子FBL共定位情况。4.构建表达GST-S100A16融合蛋白的原核表达系统,利用亲和层析分离的方法纯化GST-S100A16融合蛋白,利用GST Pull Down结合免疫共沉淀方法（Co-IP）捕获能够与S100A16结合蛋白,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后选取差异电泳条带,进行蛋白质谱分析,获得在氧化应激条件下能够与S100A16互作并且与之发生核转位有关的候选蛋白P95。5.利用GST Pull Down和Co-IP技术验证S100A16与P95蛋白互作;免疫荧光实验验证二者在氧化应激条件发生互作。6.利用RNAi技术下调P95表达,观察氧化应激条件下S100A16是否发生细胞内定位改变。7.实时荧光定量PCR分析S100A16进入细胞核后对核糖体合成的影响,实时荧光定量PCR分析47s表达变化情况。实验结果:1.Western blot结果表明S100A16在肺腺癌A549和小细胞肺癌细胞NCI-H446及NCI-H1688中表达明显,而在其他肿瘤细胞（大细胞肺癌细胞NCI-H460,小细胞肺癌细胞NCI-H209及卵巢癌细胞CAVO3）中几乎无表达;为此,本研究选取A549细胞和NCI-H446细胞作为进一步的研究对象。2.以脑微血管内细胞（HBMEC）为对照,给予H₂O₂（50uM）2小时处理,western blot结果表明,给予H₂O₂处理的NCI-H171细胞与A549细胞内S100A16的表达水平明显增加,而在正常HBMEC组S100A16表达无明显改变。3.分离H₂O₂刺激前后的肺癌细胞NCI-H446和A549不同的细胞组分,利用western blot方法检测细胞质和细胞核中S100A16的含量,结果表明H₂O₂刺激可以减少S100A16在细胞质中的含量,增加细胞核内的含量,这提示S100A16发生了细胞内位置的转变,可能由细胞质进入到细胞核内;进一步利用免疫荧光的方法观察在H₂O₂刺激条件下S100A16在肺癌细胞内的分布情况,结果表明H₂O₂可以诱导S100A16由细胞质转位进入细胞核;并且入核的S100A16明显定位于核仁区。4.成功地构建了GST-S100A16融合蛋白的原核表达系统,利用亲和层析分离的方法获得了GST-S100A16融合蛋白,GST Pull Down在肺癌细胞内寻找在H₂O₂作用下能够与S100A16结合的蛋白,同时利用免疫共沉淀方法（Co-IP）在H₂O₂处理后的肺癌细胞内去捕获能够与S100A16结合的蛋白,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后选取差异电泳条带,进行蛋白质质谱分析,获得一个候选分子——P95,为细胞核蛋白,具有转运体的功能。5.免疫共沉淀技术（Co-IP）分析在H₂O₂作用下肺癌细胞内S100A16与P95蛋白互作的情况,结果表明只有在H₂O₂作用条件存在的情况下,S100A16与P95蛋白直接存在相互结合的作用;进一步利用免疫荧光结合RNAi技术,证明了S100A16蛋白发生核转位的条件,一是外源性的氧化应激刺激,二是依赖核仁蛋白P95的帮助。6.为探寻S100A16入核后的可能作用,我们分析了核仁的主要功能,即rRNA合成情况,real time PCR分析rRNA的前体pre-47s含量,提示S100A16进入细胞核后可以诱导rDNA转录体pre-47s含量增加,该结果初步提示S100A16进入细胞核后定位于核仁,可能参与了核仁中核糖体合成过程,其机制需进一步探讨。结论:1.氧化应激刺激可以诱导肺癌细胞中S100A16表达增加,同时由细胞质进入细胞核,发生核转位的现象。2.氧化应激条件下S100A16入核依赖于核仁蛋白P95的帮助,最终定位在细胞核仁区。3.氧化应激条件下S100A16由细胞质进入细胞核,定位于核仁区后,可能调控细胞内核糖体合成,进而可能影响了细胞内蛋白质翻译的过程。