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随着工农业的快速发展,水域环境中的内分泌干扰物含量在持续增加。酚类环境污染物的化学性质稳定、不易降解,进入动物体后可产生性激素效应,对动物幼体的性腺分化及成体生殖、内分泌系统产生干扰。辛基酚(4-tert-Octylphenol, OP)可通过扰乱内分泌功能而导致动物生殖功能异常,其机制仍不清楚。类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)和芳香化酶(Cytochrome P450 Aromatase, P450arom)是类固醇激素合成中的关键酶,在两栖动物,OP通过干扰这两种酶的活性而对性激素合成产生的影响,仍需要大量实验证实。本实验以中国林蛙(Rana chensinensis)为研究对象,探讨OP对中国林蛙精巢间质细胞中StAR和P450arom表达的影响,为揭示酚类物质对动物内分泌和生殖影响的机制提供实验证据,并有助于对两栖动物生活环境的保护和治理进行评价和预测。本实验将成体雄性中国林蛙暴露于10-6、10-7、10-8mol/L OP水体中持续10d、20d、30d、40d；并设10-7、10-8 mol/L 17β-雌二醇(17β-Estradiol, E2)为阳性对照,取其精巢组织,通过原位杂交、实时定量PCR的方法检测StAR和P450arom的编码基因CYP19(Cytochrome p19) mRNA表达,利用免疫组织化学方法,检测StAR和P450arom的蛋白表达。实验结果和结论如下：1.总RNA提取之后,测定其OD260/OD280比值在1.8和2.0之间,电泳检测出现28S、18S、5S三条带,说明所提取的RNA纯度合格。用RT-PCR成功扩增出115bp的中国林蛙β-actin cDNA序列。2.用RT-PCR成功扩增了273bp的StAR cDNA序列(序列号HQ 610610),用该片段序列合成RNA探针进行原位杂交,检测OP暴露组和对照组中国林蛙精巢中StAR mRNA的表达,结果显示StAR mRNA阳性反应主要存在于间质细胞,生精细胞和支持细胞中较少。免疫组织化学检测StAR蛋白的组织细胞定位与原位杂交结果基本一致。实时定量PCR检测StAR mRNA的表达水平,在10-6mol/L OP组,随着暴露时间的延长,StAR mRNA表达量逐渐增高,暴露20 d, StAR mRNA的表达量显著增高,暴露30 d,表达量极显著增高。在10-7、10-8mol/L OP组,暴露30 d, StAR mRNA表达量达到最大值。表明StAR是对OP反应较为灵敏的作用元件,OP剂量和暴露时间的差异对StAR mRNA表达的影响较为明显。3.用RT-PCR成功扩增了322bp的CYP19 cDNA序列(序列号HQ 602881),用该片段序列合成RNA探针进行原位杂交,检测CYP19 mRNA在精巢中的表达,结果显示CYP19 mRNA阳性反应主要存在于间质细胞,生精细胞和支持细胞中较少。免疫组织化学方法检测P450arom的表达主要在间质细胞。实时定量PCR检测CYP19 mRNA的表达水平,在10-8mol/L OP组,暴露20d,CYP19 mRNA表达量显著增高,暴露40 d达到最大值。在10-6、10-7mol/L OP组,暴露10d、20d,CYP19mRNA的表达量增高不显著,暴露30 d, CYP19 mRNA的表达量显著增高,暴露处理40 d,与30 d相比,10-6mol/L OP组表达量增高不显著,但10-7mol/L OP组表达量显著增高。表明OP暴露可诱导CYP19 mRNA表达,在一定OP浓度下暴露,随着暴露时间的延长,CYP19 mRNA的表达高调,从而产生雌激素效应。4.本实验以E2作为阳性对照,10-9、10-8mol/L E2组,StAR与CYP19 mRNA的表达量显著高于10-6mol/L OP组。表明雌激素17β-E2对于StAR与CYP19的影响远大于OP。