【摘 要】
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七叶一枝花（Paris polypholla）为我国传统中药,野生资源匮乏。人工种植品已成为其市场的主要来源。然而,人工种植七叶一枝花存在品质下降问题。内生菌作为影响中药品质的关键因素之一,已成为保障与提升中药品质研究的新方向。本研究以四川省代表性种植区的五年生七叶一枝花为研究对象,采用高通量测序技术和传统微生物培养方法,对其根茎、茎和叶三种组织中的总内生细菌和可培养内生细菌的多样性、丰富度及其组
【基金项目】
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国家自然科学基金No.31370118; 国家自然科学基金No.31770134; 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目CZT18005; 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目CZ18006; 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目CZ18007; “武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室建设”基金项目（2018BFC360）; 中南民族大学2020年研究生学术创新基金项目（321
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七叶一枝花（Paris polypholla）为我国传统中药,野生资源匮乏。人工种植品已成为其市场的主要来源。然而,人工种植七叶一枝花存在品质下降问题。内生菌作为影响中药品质的关键因素之一,已成为保障与提升中药品质研究的新方向。本研究以四川省代表性种植区的五年生七叶一枝花为研究对象,采用高通量测序技术和传统微生物培养方法,对其根茎、茎和叶三种组织中的总内生细菌和可培养内生细菌的多样性、丰富度及其组成和分布特征进行分析;通过HPLC法检测其根茎、茎和叶中的重楼皂苷含量,并分析总内生细菌和可培养内生细菌与重楼皂苷含量的相关性;并将相关优势菌群与小麦幼苗共培养,筛选促生菌株;进一步将促生菌与黄芪幼苗进行共培养,分析不同时间点黄芪幼苗的生长和生理指标的变化,初步探究促生菌促进黄芪幼苗生长的机制,为后期利用内生菌改良黄芪和七叶一枝花品质的研究奠定基础。主要研究结果如下:1)采用高通量测序技术首次分析了四川地区种植的七叶一枝花的根茎、茎和叶中的总内生细菌多样性。共获得346730条有效序列,划分为1844个OTUs,分类到21个门、58个纲、143个目、245个科和502个属。根茎、茎和叶中相对丰度最高的菌属分别为鞘脂菌属（Sphingobium,8.29%）、贪铜菌属（Cupriavidus,14.03%）、甲基杆菌属（Methylobacterium,28.14%）。根茎中总内生细菌的丰富度、多样性和均匀度均高于茎和叶,根茎与茎中总内生细菌的组成更加相似。“代谢”功能预测表明,“氨基酸代谢”在根茎中相对丰度最高,“能量代谢”在茎和叶中相对丰度最高。通过检测根茎、茎和叶中重楼皂苷I、II、VI、VII的含量,发现三种组织中均含有该4种重楼皂苷。重楼皂苷I（1.496 mg/g）、II（1.122 mg/g）和VII（0.785 mg/g）在根茎中的含量最多,重楼皂苷VI（0.360 mg/g）在叶中含量最高。通过相关性分析发现总内生细菌的33个属与重楼皂苷含量呈显著正相关,其中23个属在根茎中的相对丰度最高。总内生菌之间的“协同”关系（53.21%）大于“竞争”（46.79%）关系。2)采用传统微生物培养方法从七叶一枝花的根茎、茎和叶中分离得到784株可培养内生细菌。其中,748株可培养内生细菌的16S r DNA序列被扩增,并根据其序列特征,将这些可培养内生细菌归属到4个门、7个纲、16个目、26个科、43个属。根茎中可培养内生细菌的优势菌群为不动杆菌属（40.59%）,茎中为假单胞菌属（37.08%）,叶中为芽孢杆菌属（41.18%）。根茎中可培养内生细菌多样性和丰富度均高于茎和叶。相关性分析结果表明,可培养内生细菌中的20个属与重楼皂苷含量呈显著正相关。3)选择与重楼皂苷含量显著相关的属的250株可培养内生细菌,分别与小麦幼苗进行共培养实验,初筛得到具有促生长作用的内生细菌7株,归属到4个属。进一步进行复筛验证,发现SCR21026菌株对小麦幼苗的促生效果最明显。与其共培养的小麦幼苗与对照相比株高的增长率为52%,根长的增长率为36%（第15天）。选择复筛促生效果明显的菌株SCR21026和HBR31044（前期实验室所得）分别与黄芪幼苗共培养,发现2株内生细菌仍可促进黄芪幼苗生长。与对照相比,与SCR21026和HBR31044共培养的黄芪幼苗的株高增长率分别为13.46%和11.59%,根长增长率分别为53%和49%（第5天）。4)SCR21026菌株可诱导黄芪幼苗中的可溶性糖（Soluble sugar）、淀粉（Amylum）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量的增加,过氧化物酶（Peroxidase,POD）酶活力的提高,以及赤霉素（Gibberellins,GAs）和可溶性蛋白（Soluble protein）含量的降低;其POD酶活力和赤霉素含量在第5天检测点与对照相比差异显著（P<0.01）,分别是对照的3.20倍和0.66倍;可溶性糖,MDA和可溶性蛋白含量在第10天检测点与对照相比差异显著（P<0.01或P<0.05）,分别是对照的2.52、1.46和0.86倍;淀粉含量在第15天检测点与对照相比差异显著（P<0.001）,是对照的2.14倍。HBR31044菌株可诱导黄芪幼苗的GA、玉米素（Zeatin,ZT）、淀粉和MDA含量的增加,乙烯合成酶和POD酶活力的提高,以及ABA和可溶性糖含量的降低;其GA、ZT、淀粉和MDA含量以及乙烯合成酶活力在第10天检测点与对照相比差异显著（P<0.01或P<0.05）,分别是对照的1.13、1.42、1.80和1.56及1.30倍;POD酶活力及可溶性糖含量在第5天检测点与对照相比差异显著（P<0.01或P<0.05）,分别是对照的2.73和0.74倍;ABA含量在第15天检测点与对照相比差异显著（P<0.05）,是对照的0.85倍。这些结果初步揭示了SCR21026和HBR31044菌株促进黄芪幼苗生长的生理机制。
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