背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是常见的恶性肿瘤之一,好发于我国南方及东南亚国家。病因学研究表明,鼻咽癌的发生与EB病毒感染、遗传易感性、饮食习惯及某些环境理化因素有关。鼻咽癌的发生是一个多基因参与、多步骤的复杂过程,其中抑癌基因失活和癌基因活化是肿瘤发生的重要原因。鼻咽癌有很多分化类型,常见于咽隐窝,位于咽鼓管咽口内侧角的后内侧壁。这种恶性肿瘤在大多数国家发病率较低,不到1/10万人。但在中国南部,非洲北部和阿拉斯加州,其发病率却很高,尤其多见于中国广东人和阿拉斯加州的因纽特人。有报道在广东鼻咽癌的发病率男、女各为20～30/10万和15-20/10万。鼻咽癌可发生于各种年龄,以30-50岁为发病高峰年龄,最小3岁,最大90岁,临床上以放疗和化疗为主要治疗手段,随着调强放疗(IMRT)和图像引导放疗(IGRT)技术的广泛应用和改进,鼻咽癌的疗效较十年前有了一定的提高,5年总生存率(OS)由50%提高到70%,但尚未取得满意效果。影响疗效的主要原因是放、化疗不良反应大,而且容易产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时对其他作用机制和结构不同的抗瘤药物也产生交叉抗药性。目前,寻找出高效、不良反应小且具有放射增敏作用的新一代抗肿瘤药物已是当务之急。作为一种广谱抗肿瘤分子,虽然茶多酚(EGCG)能抑制多种肿瘤的增殖,但其详细生物学机制研究不多,特别是EGCG抗NPC的研究报导较少。虽然EGCG可以通过靶向线粒体信号转导途径诱导鼻咽癌HNE2细胞凋亡,但这一过程的详细生物学机制还是不明确。EGCG在抗鼻咽癌过程中的基因甲基化所导致的表观遗传变化和信号通路的关系等诸多问题还须深入研究。人端粒酶逆转录酶(](?)iuman telomerase reverse transcriptase, hTERT是端粒酶激活的决定因子,该基因与肿瘤的形成和恶性程度有关,其表达受多种因素的调控。C-myc基因既是一种可易位基因,又是一种多种物质调节的可调节基因,也是一种可使细胞无限增殖,获永生化功能,促进细胞分裂的基因。C-myc基因参与细胞凋亡,且与多种肿瘤发生发展有关。抑癌基因RECK可以抑制基质金属蛋白酶(MMPs),从而抑制肿瘤的侵袭和转移。众多研究表明,MMPs过度表达与肿瘤的恶性程度密切相关。RECK通过抑制MMPs的生物活性可以阻碍肿瘤转移的目的。由于绿茶多酚为天然化合物,具有无毒、高效的特点,同时兼有抗肿瘤和免疫调节双重作用,明显不同于常用抗肿瘤化学合成药,在发展新型抗肿瘤药物中具有十分重要的意义,这也是合成药所不具有的优点。因此,EGCG作为一种高效低毒的抗肿瘤药物,值得进-步研究和开发,具有广阔的市场前景。小白菊内酯(parthenolide, PN)是医用草本植物小白菊的主要活性成分,在欧洲,普遍的用来治疗像发热、偏头痛、关节炎之类的炎症疾病。小白菊内酯已证实能够抑制许多肿瘤细胞的生长,或导致其死亡。更值得注意的是,小白菊内酯对肝肿瘤细胞和白血病细胞具有细胞毒作用,而对正常肝细胞和造血细胞却无影响,这表明小白菊内酯的细胞毒作用可能对肿瘤细胞具有选择性。研究目的和意义本项目通过绿茶多酚EGCG/小白菊内酯PN与体外培养的鼻咽癌细胞株/肿瘤球的相互作用,通过一系列细胞生物学和分子生物学的检测方法,研究EGCG/PN的抗鼻咽癌机制及对放射敏感性的影响,有助于为新一代靶向抗癌药物的研发提供理论基础。本项目中绿茶多酚及小白菊内酯有望开发成新型抗癌药品或保健食品,其中,小白菊内酯有可能被研发为放射增敏剂,提高鼻咽癌的放疗疗效。对于缓解化学合成药的毒副作用,减轻病人痛苦和经济负担,具有重要的临床和社会意义。本项目是涉及中药学、肿瘤学、细胞生物学、分子生物学等多学科交叉领域的研究,对促进各学科之间的融合渗透也有着积极作用,符合科学发展的趋势。采取的研究方法我们采用体外细胞培养,通过CCK-8实验、DNA梯度、凋亡检测、及甲基化、荧光定量实验、Western blot等细胞及分子生物学技术和研究方法,系统研究EGCG/PN抗鼻咽癌的生物学机制和增敏机制。本项目的创新之处肿瘤的发生是一个多步骤发展、多基因参与的复杂过程。本项目正是通过EGCG/PN的作用,一方面作用于鼻咽癌细胞周期的关键环节,抑制癌细胞的分裂增殖,诱导细胞程序性死亡,从而达到抗鼻咽癌细胞增殖的目的；另一方面,试图通过调节某些相关基因的“关”与“开”,即原癌基因的失活和／或抑癌基因的激活,有效控制肿瘤相关基因的表达。本课题的开展将为新型天然中药绿茶多酚应用于防治鼻咽癌提供新思路。实验方案[1]细胞培养、冻存、复苏方法及形态学观察常规细胞培养、冻存、复苏方法培养鼻咽癌CNE2细胞,所用培养液是DMEM。倒置显微镜下观察细胞的形态学变化,并照相。[2]CCK-8法测定绿茶多酚对CNE2细胞的生长抑制率取对数生长期的CNE2细胞株(1.0-105/细胞),分装于96孔板,培养24h后分别加入绿茶多酚EGCG,使其终浓度为25.50、100、200、400μg/ml,每组浓度设3个平行孔,空白对照为生理盐水。继续孵育48h后,加入20μ1WST-8液(5mg/ml),再培养4h,测试前加入200μ1DMSO,充分振匀后,用酶联免疫分析仪检测各孔570nm下的OD值。[3]DNA梯度电泳检测细胞凋亡DNA片断A.不同浓度绿茶多酚处理CNE2细胞取对数生长期CNE2细胞,实验组加入绿茶多酚使其终浓度为25、50、100、200、300、400μg/ml,对照组加入生理盐水,培养48h。提取细胞DNA,1%的琼脂糖凝胶电泳,自动凝胶成像系统观察、照相。B.不同作用时间的绿茶多酚处理CNE2细胞用绿茶多酚(终浓度200μg/ml)作用CNE2细胞6、12、24、36、48、72h,对照组加入生理盐水。提取DNA,1%的琼脂糖凝胶电泳,自动凝胶成像系统观察、照相。观察是否出现特征性的DNA"梯状”条带。[4]流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期A.不同浓度绿茶多酚处理CNE2细胞取对数生长期CNE2细胞,实验组加入绿茶多酚使其终浓度为25、50、100、200、300、400μg/ml,对照组加入生理盐水,培养48h。固定细胞,消化,加入1.5ml PI-碘化丙锭混匀,4℃避光染色30分钟。用200目尼龙网再次过滤。上机流式分析仪,测细胞周期和细胞凋亡。B.不同作用时间的绿茶多酚处理CNE2细胞用绿茶多酚(终浓度200μg/ml)作用CNE2细胞6、12、24、36、48、72h,对照组加入生理盐水。以下步骤同上。[5]端粒酶hTERT和抑癌基因RECK的甲基化检测100μg/mL绿茶多酚处理1×106的CNE2细胞0、1.5、3、6、12、24和36h,收集细胞,裂解,提取细胞DNA。分别设计hTERT和RECK的甲基化特异性引物,通过甲基化特异性PCR (MCP)检测这两种基因的甲基化水平,并与对照组比较。[6]端粒酶hTERT和C-Myc的表达检测100μg/mL绿茶多酚处理1×106的CNE2细胞0、1.5、3、6、12、24和36h,收集细胞,裂解,分别提取RNA和蛋白。通过real-time PCR和Western分别检测这两种基因的mRNA和蛋白的特异性表达水平,并与对照组比较。[7]EGCG联合放疗对CNE1/CNE2细胞周期及凋亡的影响。检测经EGCG和射线处理后CNE1/CNE2克隆率和细胞周期变化,与对照组比较。[8] Western blot法检测Akt表达结果。检测经EGCG和射线处理后CNE1/CNE2的Akt表达,与对照组比较。[9] EGCG联合放疗对鼻咽癌肿瘤球放射敏感性的影响。该系列实验包括肿瘤球的培养及其干性基因的检测、CCK-8法测定鼻咽癌肿瘤球克隆率和细胞周期情况、Q-PCR法及Westernblot法检测肿瘤球内AKT.NF-kB.MnSOD(SOD2)表达情况。[10]小白菊内酯(PN)联合放疗对鼻咽癌肿瘤球放射敏感性的影响.该系列实验包括共聚焦实验、CCK-8法测定鼻咽癌肿瘤球克隆率和细胞周期情况、Q-PCR法及Westernblot法检测肿瘤球内AKT、NF-κB、MnSOD(SOD2)表达情况。结果1.EGCG对鼻咽癌CNE-2细胞株的增殖具有明显抑制作用(P<0.05),且呈现时间及药物浓度依赖性。在不同四个时间点(12小时、24小时、48小时、72小时)以不同浓度的EGCG (50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL)作为实验组,以0ug/mL EGCG作为对照组(空白对照组),在相同的时间点,随着EGCG浓度增加,对CNE-2细胞抑制率逐渐上升(P<0.05),同一浓度时,随着作用时间的延长,对CNE-2细胞抑制率逐渐上升(P<0.05)。表现出时间及浓度依懒性。2. EGCG具有阻滞鼻咽癌CNE-2细胞周期进展作用,使G0/G1期比例升高(P<0.001),S期比例下降(P<0.002)。低浓度组(100ug/mL)细胞周期阻滞呈时间依赖性,随着浓度增大及作用时间延长细胞周期阻滞时间依赖性不明显,但细胞凋亡率升高。同一浓度(100ug/mL)时,随着作用时间的延长,G0/G1期比例逐渐上升,S期比例逐渐下降(样本组间比较P<0.002),表现时间依赖性。低浓度组(100ug/mL)细胞周期阻滞呈时间依赖性,随着浓度增大及作用时间延长细胞周期阻滞时间依赖性不明显,但细胞凋亡率升高。3. EGCG具有促鼻咽癌CNE-2细胞凋亡作用,随着作用时间延长其凋亡率升高(P<0.001),呈时间依赖性。 EGCG浓度较高(150ug/ml、200ug/ml)及作用时间延长时,出现明显细胞凋亡。随着作用时间延长其凋亡率升高,呈时间依赖性(各实验组间相比,P值均小于0.01),提示EGCG对鼻咽癌CNE-2细胞株有促凋亡作用,且呈时间依赖性。4. EGCG具有下调鼻咽癌CNE-2细胞株hTERT mRNA (P<0.001)及其蛋白的表达,且两者成正相关性。此实验计设为同一时间(48小时)不同浓度(0ug/mL、50ug/mL.100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL)来检测EGCG对鼻咽癌CNE-2细胞株hTERT蛋白及c-Myc表达的影响。其中Oug/mL的EGCG作为对照组,以GAPDH为内参,采用Western Blot方法检测蛋白相对表达水平。与对照组相比,随着EGCG作用浓度升高,其hTERT及c-Myc表达呈下降趋势,高浓度组(200ug/mL)较为明显。且hTERT及c-Myc下降趋势表现为一致性。5. EGCG可以抑制CNE1/CNE2的克隆,在相同剂量的EGCG的作用下,CNE1/CNE2克隆率随放射的剂量加大而逐渐下降,在6GY后,实验组(R+EGCG)较单纯照射组的克隆率下降明显(P<0.05),有统计学意义。6.各实验组(EGCG+R)与对照组相比,G2/M期百分比都是升高的,表明存在G2/M期阻滞,单纯射线组比单纯药物组对G2/M期的阻滞作用更明显,二者联合具有协同作用。7.实验各组Akt蛋白表达有明显的差异,各组蛋白相对灰度分析差异有统计学意义(P<0.05)。EGCG能抑制Akt表达,而放射线亦能抑制Akt表达,两者联合使用后Akt蛋白表达比单纯照射组降低。各组Akt蛋白相对灰度分析差异有统计学意义,说明EGCG可增强放射线对肿瘤的杀伤作用,但EGCG对放射线是协同作用还是增敏作用,其机制尚未清楚。8. EGCG和射线都可以使鼻咽癌肿瘤球克隆率下降。前面的实验已证实,EGCG对鼻癌癌细胞的克隆抑制呈浓度依赖性。现在的实验可看出,射线对鼻咽癌细胞肿瘤球的克隆抑制呈剂量依赖性(P<0.05)。 EGCG浓度相同时,随着射线剂量的增加,鼻咽癌肿瘤球的克隆率明显下降,实验组较单纯射线组下降明显(P<0.05),有统计学意义。EGCG可以增加射线对鼻咽癌肿瘤球的抑制效应。9.实验组即EGCG+放疗组的NF-κB,Akt,SOD2的表达量并没有明显低于单纯放疗组和药物组,没有统计学意义(p<0.05),或许可以这么认为,EGCG联合放疗,对鼻咽癌肿瘤细胞的杀伤作用要强于单纯放疗,它们可能是一种协同作用。当然,也有可能存在通过其他信号通路对放疗增敏的机制,今后将作进一步研究。10.从Q-PCR及Westernblot实验结果分析,射线可引起NF-κB及其下游因子MnSOD(SOD2)表达增加,其可能是肿瘤球细胞抗辐射的主要原因,经PN处理后,NF-κB和SOD2表达均明显下降(P<0.05),有统计学意义。PN下调NF-κB和SOD2的表达则增加了放射的敏感性。在本研究中,各组的Akt表达无明显变化(P>0.05)。无统计学意义。说明PN的放射增敏作用与PI3K/Akt信号通路的关系还不明确,仍有待进一步研究。11.PN可明显下调CNE1/CNE2肿瘤球β-Catenin的表达,提示其对放疗增敏作用也可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。结论EGCG对鼻咽癌CNE-2细胞株具有抑制增殖,促进凋亡作用,其可能原因是通过下调鼻咽癌CNE-2细胞株C-Myc蛋白的表达从而抑制了hTERT mRNA的转录及hTERT蛋白翻译,造成端粒酶的活性下降。EGCG对鼻咽癌肿瘤球同样有抑制增殖,促进凋亡作用。其可增加放射线对鼻咽癌肿瘤球的杀伤作用,可能机制是下调鼻咽癌肿瘤球Akt的表达,继而通过抑制其下游底物磷酸化而发挥生物学效应,起到促凋亡等功能。但EGCG对放射线是否有增敏作用尚不明确。PN对鼻咽癌肿瘤球有抑制增殖,促进凋亡作用。其对鼻咽癌肿瘤球的放射有增敏作用,可以明显增加放射线对鼻咽癌肿瘤球的杀伤作用,其机制是通过下调NF-κB及其下游因子MnSOD(SOD2)的表达而实现。EGCG和PN对鼻咽癌细胞及鼻咽癌肿瘤球均有较强的抑制增殖,促进凋亡作用。同为天然化合物,它们抗鼻咽癌的机制各不相同,但都可以研发成治疗鼻咽癌的辅助药物,且无毒或低毒。PN有可能成为治疗鼻咽癌很好的放射增敏剂和多靶点抗肿瘤药。