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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病。近年来，PED流行强度和流行区域的不断加强和扩大，给该病的防控工作带来了巨大挑战。因此，建立一种快速、特异的PEDV抗体检测方法十分必要，对该病的防控具有积极意义。 为了建立PEDV抗体间接ELISA检测方法，本研究根据GenBank发表的PEDV S1基因序列，利用Primer5.0软件，设计了一对特异性引物，应用RT-PCR方法扩增得到一条2442bp的基因片段，将其克隆至pMD19-T克隆载体，经双酶切鉴定及测序结果的分析比较，结果显示，该基因序列与GenBank发表的PEDV S1基因核苷酸序列同源性高达99％。根据S1基因优势抗原表位区基因序列，利用Primer5.0软件，设计了一对特异性表达引物，以重组质粒pMD19-T-S1为模板扩增得到一条798bp的基因片段，将其克隆至pET-32a(+)表达载体，构建了重组表达质粒pET-32a(+)-S798，将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)。含重组表达质粒pET-32a(+)-S798的菌液经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析，结果显示重组蛋白表达分子量为45ku，与预期大小一致。利用His标签纯化重组蛋白，SDS-PAGE电泳分析，结果显示纯化效果较好，无杂带。Western-blotting鉴定表明，纯化的重组蛋白具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白作为包被抗原，通过优化各步反应条件，分别建立了血清中PEDV IgG抗体、乳汁中PEDV IgA抗体两种间接ELISA检测方法。 血清中PEDV IgG抗体间接ELISA检测方法的最佳反应条件:抗原包被浓度为1.875μg/mL，37℃孵育2h后4℃包被过夜;血清稀释度为1∶40，37℃作用1h;酶标二抗稀释度为1∶500，37℃作用45min;底物最佳显色时间为15min。建立的间接ELISA检测方法不与TGEV、CSFV、PRV、PRRSV阳性血清发生交叉反应。重复性试验结果显示变异系数均小于10％。与市售试剂盒相比，特异性为91％、敏感性为89％、符合率为90％，表明建立的间接ELISA检测方法特异性强、敏感性高，为PEDV IgG抗体检测提供了一种简便快速的血清学诊断方法。 乳汁中PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法的最佳反应条件:抗原包被浓度为0.938μg/mL，4℃包被过夜;乳汁稀释度为1∶320，37℃作用1h;酶标二抗稀释度为1∶50000，37℃作用45min;底物最佳显色时间为10min。重复性试验结果显示变异系数均小于10％。与市售试剂盒相比，特异性为90％、敏感性为94％、符合率为92％，表明建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性和敏感性，为母猪乳汁中IgA抗体水平的监测提供了一种快速、特异的检测方法。