食源性疾病是一个严重的公共卫生问题,食源性致病菌的传播和感染是导致全球食源性疾病发生的主要原因之一。副溶血性弧菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌是食品中最常见的食源性致病菌。副溶血性弧菌(VP)是导致与海鲜有关的细菌性肠胃炎的主要原因,单增李斯特菌(LM)和肠炎沙门氏菌(SE)可以污染肉类,蛋类,乳类,蔬菜等多种食物,给食品安全和人类健康构成较大的威胁。因此,控制食源性致病菌及减少食源性致病菌的致病性因素对于预防食源性疾病的爆发非常重要。蓝莓是类黄酮,原花青素,黄酮醇和酚酸的极好来源,蓝莓有较高的抗氧化活性,有降低胆固醇和保护心血管的功能,并具有抗病毒活性。本文选用蓝莓的甲醇甲酸提取物,以副溶血性弧菌、单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌为研究对象研究蓝莓提取物对食源性致病菌的致病性因素的影响。首先,利用甲醇甲酸提取法进行蓝莓提取物的制备,然后测定蓝莓提取物中总酚、总糖和花青素的含量;其次,研究蓝莓提取物对副溶血性弧菌、单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌的抑菌作用,确定不抑制细菌生长的亚抑菌浓度;然后,利用亚抑菌蓝莓提取物探究了蓝莓提取物对食源性致病菌的细胞表面性质,运动性,群体感应和生物被膜等致病性因素的影响。最后,应用荧光定量PCR(RT-q PCR)探究蓝莓提取物对食源性致病菌运动性,群体感应,生物被膜形成和毒力基因转录水平的影响。本研究为降低食源性致病菌的致病性因素提供了一个新的方法,为开发无毒副作用并具有降低病原菌致病性的抑菌剂提供了理论基础。本文主要研究内容及研究结果如下:1.蓝莓提取物对食源性致病菌运动性的影响本研究利用泳动,群集和蹭行平板测定蓝莓提取物对食源性致病菌泳动性,群集性,蹭行性的影响。结果表明,亚抑菌蓝莓提取物显著降低了食源性致病菌的运动性。蓝莓提取物将副溶血性弧菌的泳动,群集和蹭行直径最高降低至5.0 cm,0.9 cm,0.6 cm;将单增李斯特菌的泳动,群集和蹭行直径降低至4.9 cm,1.3 cm,1.0cm。蓝莓提取物将肠炎沙门氏菌的泳动性和群集性完全抑制,泳动和群集运动直径降低为零,蹭行直径降低至0.8 cm。蓝莓提取物对运动性的抑制降低了食源性致病菌向更大区域扩散的能力。2.蓝莓提取物对食源性致病菌细胞表面性质的影响本研究采用微生物粘附碳烃化合物法和自动聚集法测定蓝莓提取物对食源性致病菌疏水性和自动聚集性的影响。结果表明,亚抑菌蓝莓提取物显著抑制了食源性致病菌的细胞表面疏水性和自动聚集性。副溶血性弧菌,单增李斯特菌,肠炎沙门氏菌的疏水性最高被降低至1.1%,5.0%,2.9%;自动聚集性最高被降低至2.1%,9.7%,4.7%。蓝莓提取物降低了食源性致病菌粘附于生物或非生物表面的能力。3.蓝莓提取物对食源性致病菌群体感应的影响本研究利用哈维氏弧菌BB170测定食源性致病菌的发光值,探究蓝莓提取物对食源性致病菌群体感应的影响。研究结果表明,蓝莓提取物显著降低了食源性致病菌的发光值,抑制群体感应信号分子AI-2的产生,蓝莓提取物对副溶血性弧菌,单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌信号分子的抑制率达到77%,68%和70%。蓝莓提取物显著破坏了食源性致病菌的群体感应,导致细菌群体感应调控的一系列生物学行为包括运动性和生物被膜形成以及细菌的发病机制受到影响。4.蓝莓提取物对食源性致病菌生物被膜的影响本研究利用结晶紫染色法探究了蓝莓提取物对细菌生物被膜形成的影响以及对成熟生物被膜的清除作用,利用MTT法测定蓝莓提取物对生物被膜代谢活性的影响,并利用激光共聚焦扫描显微镜观察生物被膜的结构。结果表明,蓝莓提取物抑制三种食源性致病菌生物被膜的形成,副溶血性弧菌,单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌的BFI最低被降低至0.15,0.60,0.40。蓝莓提取物清除成熟生物被膜之后,将副溶血性弧菌,单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌的生物被膜形成百分比降低至20%,50%,40%。蓝莓提取物降低了生物被膜内细菌的代谢活性,对副溶血性弧菌,单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌生物被膜代谢活性抑制率高达31.5%,64.4%,89.9%。蓝莓显著破坏了食源性致病菌的生物被膜结构,将致密的生物被膜结构瓦解为散落的细菌。5.蓝莓提取物对食源性致病菌相关基因转录水平的影响本研究通过RT-q PCR研究蓝莓提取物对食源性致病菌相关基因转录水平的影响,从基因转录水平验证蓝莓提取物对致病菌致病性因素的影响。结果表明,蓝莓提取物处理之后,副溶血性弧菌,单增李斯特菌,肠炎沙门氏菌的鞭毛运动性基因,群体感应基因和生物被膜形成基因的表达都被显著地下调,蓝莓提取物的会抑制致病菌鞭毛的运动性,降低群体感应信号分子的产生,抑制生物被膜的形成。蓝莓提取物处理之后,下调了T3SS1和T3SS2相关毒力基因的表达,可能会降低副溶血性弧菌毒力的产生;蓝莓提取物也显著下调了单增李斯特菌毒力调控因子的表达,从而单增李斯特菌的毒性将会下降。