背景和意义糖尿病是勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)的独立危险因素之一,ED更是糖尿病常见的并发症。糖尿病人群发生ED的概率是非糖尿病的3倍,发病率达到32%-90%。糖尿病性ED的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,涉及神经及神经递质、血管及血管活性物质、内分泌、代谢等多个因素。氧化应激介导的阴茎海绵体平滑肌(corpus cavernosum smooth muscle,CCSM)细胞损伤凋亡是糖尿病性ED的重要发病机制。CCSM张力改变对勃起的重要影响已经得到了公认,CCSM成为各种因素作用的终末组织,处于重要的核心地位。糖尿病状态下,阴茎海绵体组织中大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)聚集导致CCSM细胞凋亡,海绵体舒缩功能受损进而出现ED。鉴于此,我们认为减少氧化应激介导的CCSM细胞凋亡是改善糖尿病性ED的有效途径。近年来,国内外学者发现脂肪干细胞(Adipose tissue derived stem cell,ADSCs)治疗能有效地改善糖尿病性ED大鼠阴茎勃起功能,但其作用机制还不是非常清楚。目前认为,其机制可能并不是主要通过干细胞分化并替代受损的平滑肌细胞或其他细胞起作用,而是干细胞携带的某些有效成份,如营养因子、细胞因子及信号分子等,通过旁分泌起了决定性作用。外泌体(exosomes,EXOs)是细胞在生理或者病理状态下分泌的直径为40-1OOnm的双层膜囊泡。EXOs内含有蛋白质、脂质及RNA等生物活性物质,可通过传递或交换生物活性物质促进细胞间信息沟通,是细胞间交流的关键信使。那么EXOs是否就是ADSCs移植通过旁分泌进而改善ED大鼠阴茎勃起功能的关键成份,其改善糖尿病性ED的分子机制是什么?核因子相关因子2(Nuclear factor E2-related factor2,Nrf2)作为细胞调节抗氧化应激反应的关键转录因子,它可与抗氧化反应元件(Antioxidantresponse element,ARE)结合,上调抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,增强细胞的抗氧化能力,因此Nrf2信号通路在细胞防御外源性或内源性的氧化应激过程中起重要作用。近年来研究发现,Nrf2信号通路对多种以氧化应激为主要发病机制的疾病都具有保护作用,然而ADSCs-EXOs减少CCSM细胞凋亡改善糖尿病性ED的机制是否是通过Nrf2通路来起作用的呢?为深入研究ADSCs治疗糖尿病性ED的机制,本研究通过动物和细胞实验研究ADSCs-EXOs治疗糖尿病性ED的作用,并深入讨论其改善阴茎勃起功能的分子机制,明确Nrf2-ARE通路是否是EXOs减少氧化应激介导的CCSM细胞凋亡的分子机制。这将为ADSCs-EXOs作为无细胞治疗新方法提供理论依据,无疑将使糖尿病性ED的治疗达到一个新的高度。方法1.酶消化法从大鼠腹股沟脂肪组织中分离得到ADSCs,成骨及成脂分化诱导和流式细胞仪检测干细胞表面标志物来鉴定ADSCs。超速离心法获取ADSCs-EXOs,用纳米粒子示踪仪,透射电镜及western blot对其进行鉴定。2.采用高脂饮食加多次低剂量的链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)腹腔注射构建Ⅱ型糖尿病大鼠模型,用ADSCs、ADSCs-EXOs、PBS经阴茎海绵体注射处理,正常大鼠为假手术组,4周后检测阴茎勃起功能,CCSM及内皮细胞数量,细胞凋亡数量,氧化应激水平及Nrf2-ARE通路蛋白的表达。3.组织块贴壁法原代培养CCSM细胞;用H202处理细胞作为细胞氧化应激损伤模型;不同浓度的ADSCs-EXOs处理细胞24-48h后,再用H202处理细胞,评估细胞活力,凋亡及氧化应激水平,检测Nrf2-ARE通路蛋白的表达和Nrf2细胞核浆转位。合成siRNA-Nrf2序列并转染CCSM细胞,检测Nrf2-ARE通路蛋白表达,评估细胞活力,氧化应激水平和细胞凋亡,检测细胞中Akt和MAPK通路蛋白表达。结果1.ADSCs培养及ADSCs-EXOs的提取鉴定原代培养的ADSCs呈不规则梭形或者多角形,成脂与成骨分化培养结果显示,在成脂诱导条件下,油红O染色发现细胞内出现许多红色的脂肪颗粒;在成骨诱导条件下,茜素红染色发现细胞出现红色结节状的成骨结节。流式细胞结果显示:ADSCs表达CD90和CD29,不表达CD45。NTA检测EXOs结果发现:大部分粒子都处于EXOs直径的范围(<200 nm),含量最多的粒子直径约为76mn,浓度为9.76*108个/ml;透射电镜检测到EXOs呈杯口样形态,直径在100nm左右的双层膜囊性小泡,进一步用Western blot分析发现,我们所提取出的物质阳性表达CD63、CD81蛋白,不表达存在细胞内质网的蛋白calnexin。2.ADSCs-EXOs改善大鼠糖尿病性ED高脂饮食加多次低剂量STZ腹腔注射后,糖尿病大鼠成模率100%。阴茎组织冰冻切片检测组织中PKH26标记的ADSCs-EXOs,结果显示:随着注射EXOs后时间的增加,组织中停留的ADSCs-EXOs数量逐渐减少,在阴茎海绵体注射后第21d,组织内EXOs明显开始减少,在28d时阴茎海绵体中仅存留的极少量的EXOs。PBS组糖尿病大鼠阴茎海绵体内压(ICP)/劲动脉压(MAP)(<60mmHg)明显低于正常组,即出现ED。糖尿病大鼠ADSCs-EXOs或ADSCs阴茎海绵体注射治疗4周后,ICP/MAP比值,a-SMA和CD31蛋白表达水平,平滑肌与胶原蛋白比例和Bcl-2蛋白表达水平明显较PBS治疗组糖尿病大鼠高,而caspase-3蛋白表达水平,平滑肌细胞及内皮细胞凋亡的数量明显较PBS治疗组糖尿病大鼠低。冰冻切片DHE染色结果表明,糖尿病大鼠阴茎海绵体组织及CCSM细胞中DHE红色荧光强度明显增多,与PBS组相比,经过ADSCs或ADSCs-EXOs治疗4周后,大鼠阴茎海绵体组织及CCSM细胞中DHE红色荧光强度显著减少。Western blot及免疫组化结果显示,糖尿病大鼠阴茎组织中Nrf2,HO-1及NQO-1表达增多。与PBS组相比,经过ADSCs或ADSCs-EXOs治疗4周后,大鼠阴茎海绵体组织中Nrf2,HO-1和NQO-1表达水平均显著增加。3.Nrf2在EXOs减少氧化应激介导的CCSM细胞凋亡中的关键作用细胞呈典型的“峰-谷”样生长或者排列呈旋涡状。细胞免疫荧光结果发现,约97%细胞胞质呈现绿色荧光为α-SMA阳性,约96.5%的细胞胞质呈现为红色荧光为smoothelin阳性即CCSM细胞。PKH26标记的ADSCs-EXOs,加入CCSM细胞培养液中培养12h,结果显示:CCSM细胞中可见红色颗粒样物质在胞浆聚集,提示在体外,CCSM细胞可吞噬ADSCs-EXOs。用不同浓度的ADSCs-EXOs预处理细胞24-48h后,再用200uMH2O2处理12h,CCK-8检测结果显示,H202显著抑制CCSM细胞活力,减少细胞数量;浓度为50ug/ml的ADSCs-EXOs能显著缓解H2O2对细胞活力的抑制,增加细胞数量。流式细胞仪及Western blot结果显示,H2O2能显著诱导CCSM细胞凋亡,而浓度为50ug/ml的ADSCs-EXOs能显著抑制H2O2诱导的细胞凋亡。用不同浓度的ADSCs-EXOs预处理细胞24-48h后,再用200uM H202处理4h,荧光显微镜观察及流式细胞仪检测结果均发现,与对照组相比,H2O2处理组CCSM细胞红色荧光密度明显更高,而50ug/ml的ADSCs-EXOs能显著减少H2O2诱导产生的细胞红色荧光密度值;SOD及CAT活性试剂盒检测结果显示,与对照组相比,H2O2处理组CCSM细胞SOD及CAT活性更低,而50ug/ml的ADSCs-EXOs能显著提高H2O2诱导抑制的SOD及CAT活性。4.Nrf2在ADSCs-EXOs减少氧化应激介导的CCSM细胞凋亡的作用不同浓度的ADSCs-EXOs预处理细胞24-48h后,再用200uMH2O2处理12h,Western blot和荧光定量PCR结果表明,50ug/ml的ADSCs-EXOs能明显促进H202诱导的平滑肌细胞Nrf2、HO-1和NQO-1的基因及蛋白表达。核浆蛋白western blot结果表明,50ug/ml的ADSCs-EXOs能促进CCSM细胞胞核中Nrf2的表达,减少细胞胞浆中Nrf2的表达。细胞免疫荧光结果显示,NC组CCSM细胞中Nrf2表达很少,H2O2能促进细胞Nrf2的表达,但是Nrf2主要聚集在细胞质,而随着ADSCs-EXOs浓度的增加,Nrf2明显向细胞核内聚集。干扰CCSM细胞Nrf2后,western blot检测结果显示,干扰Nrf2能显著抵消ADSCs-EXOs促进CCSM细胞中Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表达;CCK-8结果显示,干扰Nrf2能明显减少CCSM细胞活力,显著抵消ADSCs-EXOs改善H202诱导的细胞活力;Western blot检测CCSM细胞中凋亡相关蛋白,结果显示干扰Nrf2能明显增加Bax/Bcl-2比值及促进Caspase3的表达,显著抵消ADSCs-EXOs减少H2O2诱导的Bax/Bcl-2比值增加和Caspase3表达增加;ADSCs-EXOs预处理细胞后用200uM H202处理4h,DHE荧光探针染色结果发现,干扰Nrf2能明显增加CCSM细胞DHE的红色荧光光密度值,显著抵消ADSCs-EXOs减少CCSM细胞中DHE的红色荧光光密度值。SOD及CAT试剂盒检测结果表明,干扰Nrf2能明显减少CCSM细胞中SOD及CAT的活性,显著抵消ADSCs-EXOs上调CCSM细胞中的SOD及CAT的活性。Western blot检测细胞中Akt及MAPK通路蛋白结果发现,ADSCs-EXOs能显著促进P-Akt,P-ERK1/2,P-P38和P-JNK的蛋白表达。结论1.原代培养可成功培养出较纯的ADSCs,且ADSCs培养上清通过超速离心法可获得较纯的ADSCs-EXOs。2.ADSCs-EXOs经阴茎海绵体注射后可部分停留在阴茎组织内,且可被CCSM细胞摄取;ADSCs-EXOs可减少大鼠CCSM细胞凋亡,从而改善糖尿病性ED。3.ADSCs-EXOs能活化Nrf2-ARE通路,显著减少大鼠阴茎海绵体及平滑肌细胞氧化应激水平,可能是其改善糖尿病性ED的关键机制。4.体外通过组织块加差速贴壁离心法可获得较纯的大鼠CCSM细胞,且体外培养的CCSM细胞可主动吞噬ADSCs-EXOs;ADSCs-EXOs可活化Nrf2-ARE通路,减少氧化应激介导的CCSM细胞凋亡;Nrf2活化是ADSCs-EXOs减少氧化应激介导的CCSM细胞凋亡的关键分子。5.ADSCs-EXOs磷酸化Akt及MAPK通路并使其活化可能是其活化CCSM细胞中Nrf2-ARE通路的关键分子机制。