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狂犬病病毒(Rabies Virus, RV) CTN-181株是由我国自行分离研制的人用疫苗株继续培养而来的弱毒株,具有更加安全且高效激活机体免疫反应的优点,已经被考虑应用于狂犬疫苗的生产和应用。将CTN-181株进一步发展为病毒载体,用于基因工程疫苗以及承载外源基因等相关研究,将具有更长远的应用前景。为此,本研究选择CTN-181株拟构建基于病毒全基因组并插入标识基因的载体系统,再将其初步应用于HCV和RV的重组疫苗的探索性研究。第一部分：CTN-181株狂犬病病毒载体系统的构建以CTN-181株全基因组为骨架,构建复制型和非复制型RV载体,并以分泌性表达的Gaussia Luciferase (Gluc)作为报告基因验证病毒载体的可行性。复制型载体(CTN-Gluc)保留了病毒基因组所有转录元件和编码基因,非复制型载体(CTNAG-Gluc)缺失了糖蛋白编码基因。由于RV为负链RNA病毒,除了含有报告基因的重组完整基因组质粒(CTN-Gluc/CTNAG-Gluc),还需要提供复制元件的辅助质粒(pVAX-N;-P,-L/pVAX-N,-P,-G,-L),通过共转染方式拯救重组病毒。为了解病毒载体的自主复制能力及报告基因在嵌合基因组中的传代稳定性,于转染72h后收获P1代病毒上清在正常的BHK-21细胞中连续传代。利用免疫荧光技术(DFA)可以在转染和1-3代传代细胞中检测到复制型重组病毒颗粒,而只能在转染和／或第一代传代细胞中检测到非复制型重组病毒颗粒,证明所构建的复制型和非复制型病毒载体均拯救成功,但是在正常细胞中只有复制型载体具有自主复制能力。同样,对于复制型载体来说,利用反转录PCR技术(RT-PCR)可以在转染和1-3代传代细胞上清液扩增出预期大小的目的DNA片段(220bp)；而对于非复制型载体来说,只能在转染和/或第一代传代细胞上清中扩增出目的片段。由于该片段跨报告基因和病毒基因组,所以结果证明在复制型载体中报告基因可以随着病毒基因组的复制而复制,具有传代稳定性。病毒滴度测定结果显示,转染后获得的重组病毒滴度在103-104FFU/ml之间,复制型重组病毒滴度随着传代次数的增加有逐渐上升的趋势,传代1-3次过程中稳定在104-105FFU/ml之间,再次证明重组病毒载体具有自主复制能力,且随着传代次数的增加能够适应细胞培养。为了解重组病毒载体对报告基因的表达能力,分别于转染后24/48/72/96h以及传代后的72h分别收集25ul细胞上清进行Gluc表达活性的定量检测。结果发现不同类型载体对报告基因的表达趋势相似,且GIuc表达活性持续升高,均在转染后72h(CTN-Gluc:3.5-5.3×104RLU:CTN△G-Gluc:8.1-8.8×104RLU)达到高峰。在传代后,复制型重组病毒能够继续检测到Gluc表达活性,且较转染时升高(0.9-1.2×105RLU),而非复制型重组病毒在传代后丧失了Gluc表达活性。结果表明所构建的复制型和非复制型RV载体均能表达报告基因,但是表达能力略有差异,非复制型载体高于复制型载体。通过比较Gluc表达活性,我们分析了影响重组病毒拯救效率的两种因素,进行了如下研究：(1)比较在转染时添加和不添加表达糖蛋白的辅助质粒pVAX-G时重组病毒对Gluc表达活性,结果发现添加后重组病毒对Gluc表达活性曲线均比不添加时的曲线有所升高,说明转染时添加辅助质粒pVAX-G有助于重组病毒的包装和对报告基因的表达。(2)比较GP333位氨基酸突变后重组病毒对Gluc的表达活性的改变,结果发现由弱致病性的谷氨酰胺突变为强致病性的精氨酸时重组病毒CTN/GQ333R-Gluc对Gluc表达活性明显下降,且达到高峰时间推迟(转染后96h达到高峰时Gluc测定值为0.6-2.5x104RLU),说明GP333位为谷氨酰胺时更有利于报告基因表达。第二部分：表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E1E2的RV/HCV嵌合病毒的构建在上述研究的基础上,进一步构建和拯救了狂犬／丙肝嵌合病毒。将HCV E1E2基因分别克隆入复制型(CTN-E1E2和CTN/GQ333R-E1E2)和非复制型RV载体(CTN△G-E1E2)。嵌合病毒克隆和辅助质粒共转染后72h后,收集P1代病毒上清在BHK-21细胞中作连续传代。对每一代细胞进行免疫荧光检测均能发现重组病毒颗粒的产生,对每一代细胞上清进行RT-PCR检测均能得到预期大小的跨越HCVE1E2基因和RVL基因的目的DNA片段(480bp)。表明所构建嵌合病毒具有自主复制能力,并且外源基因HCV E1E2在嵌合病毒基因组中能够稳定传代。虽然嵌合病毒的免疫效果也需要通过动物实验来评价,但是成功拯救的嵌合病毒为发展新型丙肝载体疫苗奠定了基础。第三部分：双表达糖蛋白的重组RV构建前期研究通过对我国使用的主要疫苗株和分离的代表性流行株进行了全基因组序列测定和比较,证明了CTN-181株和我国现行流行株最为接近。它是在CTN-1株基础上进一步减毒,作为疫苗株会更加安全。另外,GP是唯一激发产生中和抗体的病毒抗原,过表达GP能够在更高水平激发中和保护效果。因此本研究又构建和拯救了双表达GP的重组RV (CTN/2G和CTN/2GQ333R).重组病毒克隆和辅助质粒共转染后72h后,收集P1代病毒上清在BHK-21细胞中作连续传代。对每一代细胞进行免疫荧光检测均能发现重组病毒颗粒的产生,对每一代细胞上清进行RT-PCR检测均能得到预期大小的跨RV G和L基因的目的DNA片段(220bp)。表明所构建的重组病毒具有自主复制能力,并且过表达的G基因在重组病毒基因组中能够稳定传代。病毒滴度测定结果显示重组病毒滴度在104-105FFU/ml-之间,并且随着传代次数的增加有逐渐上升的趋势。虽然重组病毒的免疫效果也需要通过动物实验来评价,但是成功拯救的重组病毒为发展狂犬病减毒活疫苗奠定了基础。综上所述,本研究成功构建了具有自主知识产权的基于CTN-181株的复制型和非复制型RV载体系统,并引入了方便外源基因克隆的两个亚克隆。复制型RV载体经证实具有自我复制能力和表达外源基因的能力,而非复制型能够在更高水平表达外源基因,为RV载体的进一步应用建立了技术平台。在此基础上成功拯救了狂犬／丙肝嵌合病毒以及双表达GP的重组RV,尽管较低的重组病毒滴度影响了后续的动物免疫效果评价,但也为采用反向遗传操作技术研究新型HCV疫苗和狂犬病减毒活疫苗进行了有益的探索,同时也可作为研究RV致病机理的分子模型。