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目的对以Notch2为表面标志的胰腺癌干样细胞进行分离鉴定和组织定位,并探索其靶向治疗方法。方法将人胰腺癌细胞株Panc-1、Bxpc-3、Aspc-1、Cfpac-1在无血清条件下培养,采用EGF, IGF-1和FGF-10诱导形成细胞球体。用免疫荧光法分别检测这4种人胰腺癌细胞株及其球体细胞、15例胰腺癌和13例正常胰腺组织标本以及吉西他滨作用后Panc-1细胞中自我更新调控因子OCT4和Nanog的表达。采用磁性细胞分选技术纯化胰腺癌Bxpc-3和Panc-1细胞株中的Notch2+细胞,通过NOD-SCID小鼠皮下移植评估其致瘤能力,在无血清条件下培养观察其球体形成能力,应用免疫荧光检测法检测干细胞相关标志OCT4、Nanog和PDX1的表达,并通过基因测序检测其K-ras基因突变的情况。在培养基中加入吉西他滨,以了解Panc-1细胞中Notch2+细胞的耐药情况。选取胰腺癌和正常胰腺组织标本各4例进行Notch2蛋白的免疫组化染色。对胰腺癌Bxpc-3细胞分别进行Notch2联合水通道蛋白AQP1和AQP5的特异性免疫荧光检测。分别以Notch信号通路抑制剂Compound E (CE),Ras信号通路抑制剂BIO.SB239063和U0126对Notch2+Bxpc-3细胞作用后,用CCK-8法测定其细胞活力。用免疫荧光法检测CE抑制Notch2通路前后Notch2+Bxpc-3细胞OCT4、Nanog、PDX1和AQP5的表达。结果4种人胰腺癌细胞株在无血清DF12培养液中5-10d后即可形成悬浮生长的球体。OCT4和Nanog在4种细胞株中均有表达,且球体细胞中表达明显高于亲代细胞,在吉西他滨作用后的Panc-1细胞也呈高表达。胰腺癌组织中仅有少量表达OCT4和Nanog,正常胰腺组织中有微量表达。此外还检测到受OCT4调控的表面标志SEMA6A在Panc-1球体细胞中呈高表达。Notch2+胰腺癌细胞具有显著致瘤性,阳性表达胚胎干细胞核心转录因子OCT4、Nanog和PDX1,在无血清条件下培养能形成细胞球体,并存在K-ras基因的突变。吉西他滨作用后胰腺癌Panc-1细胞中Notch2+细胞比例上升。在胰腺癌和正常胰腺组织中Notch2+细胞定位于泡心细胞和终末导管细胞,表达AQP1和AQ.P5。酶抑制剂CE、BIO、SB239063和U0126对Notch2+Bxpc-3细胞均有一定的抑制作用,其中γ-分泌酶抑制剂CE虽可抑制Notch2+细胞增殖,但不能诱导其分化。结论胚胎干细胞核心转录因子OCT4和Nanog在胰腺癌细胞中的表达与CSC有关,可以作为胰腺癌干细胞自我更新功能鉴定的标志之一,其调控的表面蛋白SEMA6A作为胰腺癌干细胞表面标志物值得进一步研究。人胰腺癌Notch2+Bxpc-3和Panc-1细胞具有肿瘤干细胞特性。研究结果支持胰腺癌的泡心细胞起源说。靶向阻断Notch和ras通路的药物治疗对Notch2+胰腺癌干样细胞有效。