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猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV),简称猪乙脑,是由日本乙型脑炎病毒引起一种人畜共患的虫媒病毒性疾病。该病对养猪业造成严重危害,在公共卫生上具有重要意义,本实验运用JEV的E蛋白作为包被抗原建立了检测猪乙脑抗体的间接ELISA方法,并在此基础上研制了可用于临床检测猪乙脑抗体的间接ELISA试剂盒。1.重组E蛋白包被抗原的制备首先复苏了本实验室保存的E蛋白表达菌株pET28a(+)-E (BL21)重组菌,用PCR方法鉴定该菌之后,通过IPTG诱导其表达E蛋白,运用SDS-PAGE鉴定表明实验室保存的pET28a(+)-E (BL21)重组菌仍然能大量表达E蛋白。通过对E蛋白的NI离子亲和层析纯化和透析复性,制备了具有较好反应原性的包被抗原E蛋白。2.间接ELISA抗体检测方法的建立用纯化复性的E蛋白作为包被抗原,对抗原的最佳包被浓度、血清最佳稀释度、抗原的包被条件、封闭液种类、血清最适作用时间、酶标二抗的最适作用时间、底物显色时间进行了优化。结果表明,抗原的最佳包被浓度为7.1ug/m1,血清的最佳稀释度为1：80,抗原的包被条件为37℃包被1h后4℃包被过夜,选用的封闭液为1%BSA,血清和酶标二抗的反应时间均为1h,底物的显色时间为10min。3.猪乙脑病毒间接ELISA抗体检测试剂盒组装和质量评价利用建立的间接ELISA检测方法,研制了猪流行性乙型脑炎病毒抗体检测试剂盒。对试剂盒进行敏感性、特异性、重复性、保质期的研究,结果表明,试剂盒在敏感性上同商品化试剂盒相当；特异性方面,不与伪狂犬病(PR)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪瘟(HC)的阳性血清发生反应,检测结果均属于阴性；重复性方面,实验结果表明试剂盒对同一血清检测结果的变异系数都在5%左右,具有较好的重复性；试剂盒在4℃条件下保存4个月检测结果仍一致。本研究为日本乙型脑炎病毒的临床诊断和免疫后抗体监测提供了快速、简便且对设备和技术人员要求不高的适合基层使用的检测方法,也为日本乙型脑炎病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的商品化奠定了一定基础。