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背景遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)是一种常染色体显性遗传性疾病,由错配修复(mismatch repair, MMR)基因种系突变引起,占所有结直肠癌的5%-10%。HNPCC最有效的治疗手段是内镜下或外科手术切除肿瘤,如果能早期发现原发和复发肿瘤,并及时治疗,可以明显改善预后。MMR基因种系突变的检测已经成为HNPCC确诊的金标准,但是较多的研究提示部分家系(包括一些高度微卫星不稳定肿瘤家系)始终找不到已知MMR基因种系突变。有研究表明错配修复基因启动子区CpG岛的过度甲基化也是导致基因失活、肿瘤发生的一种机制。迄今,有关HNPCC患者基因组DNA中MLH1、MSH2过甲基化检测报道较少,检测MMR基因的甲基化可能为HNPCC的筛选和监测提供一种手段,并为HNPCC的诊断、治疗提供一个新的思路。目的了解国人遗传性非息肉病性结直肠癌中错配修复基因MLH1、MSH2启动子区CpG岛的过甲基化状态,探讨MLH1、MSH2基因DNA甲基化与遗传性非息肉病性结直肠癌发生的关系,从而为HNPCC的筛选和监测提供一种手段,并为HNPCC的诊断、治疗提供一个新的思路。材料与方法研究对象我科收集的106个HNPPC家系中先证者,经微小突变检测和大片断缺失检测后,以未发现种系突变的47个HNPCC患者标本为研究对象。后期,又增加符合阿姆斯特丹标准Ⅱ(AC-Ⅱ)的同一家系标本4个,这些患者先期已证实有MSH2基因突变。方法1)基因组DNA提取:按试剂盒提供的步骤进行操作,所提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,使用紫外分光光度计进行定量后于-20℃保存。2)基因组DNA的硫化处理:按试剂盒提供的步骤进行操作,对至少1μg的基因组DNA进行转化,处理后的DNA于-20℃保存。3)用MSP法检测MLH1、MSH2基因启动子区的甲基化状态:同一标本以甲基化引物和非甲基化引物分别进行PCR扩增。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳。紫外灯下观察目的条带。判定标准:若扩增出M(methylation)的特异性条带,则说明有甲基化:仅有M条带为完全甲基化,同时有M条带和U(unmethylation)条带为部分甲基化;若仅扩增出U的特异性条带,则说明无甲基化。结果(1)在47个标本中,发现6个存在MLH1基因启动子区过甲基化,发生率为12.8%。分析MSP电泳图可见,存在MLH1基因启动子区甲基化的6个标本包括:4个完全甲基化,2个部分甲基化;(2)在36个标本中,发现27个存在MSH2基因启动子甲基化,发生率75.0%,其余9个(25.0%)为非甲基化。由电泳图可见,存在MSH2基因启动子甲基化的27个标本只扩增出特异性条带M,表现为完全甲基化,其余标本仅扩增出特异性条带U,表示这9个标本除未检出微小突变和大片段缺失外,也未发现有甲基化现象;(3)后加入4个标本(同属一家系,且已证实有MSH2基因突变),由电泳图可见,存在MSH2基因启动子完全甲基化。结论(1)在遗传性非息肉病性结直肠癌中,MSH2基因启动子区的CpG岛有高频率的甲基化,是肿瘤发生过程中的一个重要因素;而MLH1基因启动子区甲基化在遗传性非息肉病性结直肠癌中相对少见;(2)在实验中发现,DNA甲基化主要发生在AC-II家系中,提示基因过甲基化可能有遗传的特性,即表遗传学机制可能具备遗传性;(3)在其中一个家系中,MSH2种系突变合并MSH2基因启动子CpG岛过度甲基化现象,除证实基因甲基化状态和种系突变一样具备遗传特性外,也提示二者对肿瘤的发生可能有协同作用。