神经元是神经系统的结构和机能单位,神经的损伤或疾病引起的神经元的变性、退化或丧失是不能或很难再生的。中枢神经系统的损伤修复至今仍无有效的治疗方法,因此寻找理想的治疗方法是当前研究的重要课题。目前研究较多的是用神经干细胞移植(NSCs)的方法来代替受损细胞,但是研究表明移植入的细胞到达损伤部位的为数很少,而对NSCs的分化机制也尚不清楚,且诱导NSCs定向分化的调控机制及技术亦未成熟,因此利用组织工程技术来诱导损伤修复细胞的迁移成为最近的研究热点。丝素蛋白由于其具有生物相容性好、易加工成各种形状、可在生物体内缓慢降解、来源丰富等优点而倍受关注。目前对家蚕丝素蛋白的研究已有大量报导,而柞蚕丝素蛋白的研究还处于起步状态,柞蚕丝素蛋白具有独特的有利于细胞粘附的RGD三肽序列,因此柞蚕丝素蛋白极具开发潜力。为探索神经元与丝素蛋白材料结合的可行性及生物相容性,本研究首先建立了一个较纯的神经元培养体系,即从新生大鼠脑室下区(Subventricular Zone, SVZ)分离细胞,分别以低密度培养在柞蚕、家蚕两种丝素蛋白溶液制成的二维薄膜材料以及三维纳米纤维材料上,在特定的培养基培养三天后开始向神经元分化。免疫荧光染色观察神经元的生长发育并检测其成活率、复杂度。从成活率分析,神经元在柞蚕丝素蛋白二维、三维材料上均比家蚕丝素蛋白材料高,而三维材料上神经元的存活率又比二维材料高;从复杂度分析,神经元在柞蚕丝素蛋白二维、三维材料上均比家蚕丝素蛋白材料高,而三维材料上神经元的复杂度又比二维材料高。从而得出结论:丝素蛋白材料支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;柞蚕丝素蛋白材料比家蚕丝素蛋白材料更适合神经元的生长;三维纳米纤维材料比二维薄膜材料更适合神经元的生长。体外分离纯化培养的神经元缺乏支持细胞以及各种细胞因子,且神经元没有分裂增殖能力,从而存活时间较短,在本实验中第五天开始出现明显凋亡现象,因此接下来本研究进行了混合培养系统与丝素蛋白材料结合的研究,研究在有胶质细胞支持作用下神经元的生长发育。即从SD新生大鼠大脑皮层分离细胞,接种在柞蚕、家蚕丝素蛋白来源的二维薄膜材料以及三维纳米纤维材料上,用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养六天,底层胶质细胞已基本汇合,上层含有少量的神经前体细胞,此时换成无血清培养基(DMEM serum free plus N2 Supplement)后,神经前体细胞大量增殖,最终分化为神经元。免疫荧光染色观察以及BrdU掺入法检测神经前体细胞增殖,分析结果发现:与家蚕丝素蛋白相比,柞蚕丝素蛋白有助于细胞的粘附;与二维材料相比,三维材料有助于细胞粘附;从BrdU掺入结果分析,柞蚕丝素蛋白上神经前体细胞的增殖比例比家蚕丝素蛋白高,而三维材料与二维材料在神经前体细胞的增殖方面未见明显差别;然而从细胞形态的复杂程度来看,柞蚕、家蚕丝素蛋白材料均支持神经元的分化,且三维纳米纤维材料上神经元具有较高的复杂度,能形成神经网络状结构。成熟的神经元是分裂后细胞,不具有DNA复制和细胞增殖功能,迄今为止,体外分离培养神经元依然面临着许多困难,在一些细胞量需要大、观察时间长的实验研究中,体外原代培养的神经元很难满足实验的要求。因此,就需要寻找一种能够反映神经元特性,具有神经元表型特征的体外替代细胞。PC12细胞是大鼠嗜铬细胞瘤单克隆细胞株,从发育学角度看,嗜铬细胞和交感神经下细胞同源,体外培养时从形态到功能常表现出神经元的本质,一般作为神经元模型。PC12细胞内含有合成多种神经递质的关键酶,因而具有分化为各种神经元表型的潜能。实验将PC12细胞与丝素蛋白材料相结合,并以全反式维甲酸(RA)为诱导剂诱导PC12细胞向神经元分化。通过免疫荧光染色观察以及对PC12细胞诱导分化来的神经元成活率、复杂度的检测分析发现:丝素蛋白薄膜和丝素蛋白纳米纤维对PC12细胞具有良好的生物相容性,能支持PC12细胞的存活与生长;PC12细胞在丝素蛋白薄膜和丝素蛋白纳米纤维上能被诱导分化为神经元。并且证实了PC12细胞在丝素蛋白材料上诱导分化的过程中,丝素蛋白材料本身不影响RA对PC12细胞的诱导分化作用。这些结果表明丝素蛋白材料可作为神经类细胞生长的良好生物支架材料,而柞蚕丝素蛋白有着更为广阔的研究前景。本研究为神经干细胞结合丝素蛋白材料应用于临床移植修复神经系统损伤提供理论基础和实验依据。