相对较低的骨密度是衡量骨质疏松症的主要特征之一。形成骨质疏松症的主要原因是由成骨细胞主导的骨生成和由破骨细胞主导的骨吸收的严重不平衡。作为全球性的流行病之一,骨质疏松症已经严重威胁到人类的健康。全球每年有成千上万的人因为骨质疏松症导致的骨折而致残甚至间接致死。单核细胞作为破骨细胞的前体,通过破骨细胞的骨吸收作用间接参与骨代谢活动。由于成骨细胞和破骨细胞的提取和分离比较困难,相反,外周血单核细胞的分离提取技术日趋成熟,其提取和纯化率可以达到90%以上,因此,作为理想的针对骨代谢的研究材料,单核细胞被广泛应用。蛋白质作为人类生命活动的直接执行者,其表达水平的变化可能直接导致某些生理功能的异常,甚至导致疾病发生。蛋白质组学研究应用在骨质疏松研究领域尚未大规模开展。本研究使用高效液相色谱和质谱的联用技术系统地对外周血单核细胞开展细胞水平和亚细胞水平定性和定量研究,结合系统生物学通路和网络分析的手段鉴定与骨质疏松相关的蛋白和基因。骨质疏松症理论上可能发生在男性和女性人群的各个年龄阶段。本论文包含两个相关联的研究。研究I是针对33个高加索女性人群进行的细胞水平的蛋白质组学研究。研究Ⅱ是针对59个高加索男性人群进行的亚细胞水平的蛋白质组学研究。本论文的主要工作:1.招取随机人群,采集表型数据,抽取外周血。参与研究的样本通过问卷调查的方式,排除由于遗传疾病或极端生活习惯异常可能导致骨质疏松的样本。同时,问卷也记录了一系列的参数如身高、体重等。对合格的样本由专业人员抽取外周血。然后,使用专门的仪器对骨密度进行测量,根据骨密度值将样本分为高低骨密度组。2.蛋白质样本的提取和制备。该过程包括从新鲜的外周血中提取单核细胞、从单核细胞中提取蛋白质,测定蛋白浓度,对蛋白质进行酶切等过程。3.基于液相色谱和质谱仪联用的蛋白质组学分析。制备好的蛋白样本注入液相色谱和质谱仪进行蛋白质定性和定量分析。该部分是本论文实验的核心。4.基于蛋白质组学数据的生物信息学和统计学分析。主要包括通过t检验的方法分别对研究I和研究II中的高低骨密度组之间蛋白质表达水平进行比较分析,从而鉴定出差异表达的蛋白质(统计阈值P<0.05);基于差异表达蛋白质进行的生物学通路分析和网络分析;这两项是本论文数据分析的核心。最后,在全基因组水平和转录组水平对蛋白质组学研究结果进行验证。本论文主要创新点如下:1.将定量蛋白质组学技术与系统生物学通路和网络结构分析相结合,应用在骨质疏松研究领域。2.将多重组学包括蛋白质组学、全基因组学和转录组学创新性系统整合方法应用在骨质疏松研究领域。3.研究结果中揭示了一系列新的与骨质疏松病理相关的潜在风险基因和生物学通路。本研究具体结果如下:在研究Ⅰ中共鉴定出30个差异表达的蛋白。在研究Ⅱ中则鉴定出36个差异表达的膜蛋白。从统计值和具体的生物学功能综合考虑,分别从研究Ⅰ和研究Ⅱ的结果中挑选出一些重要的基因和相关的生物学通路在本论文中进行报道。研究Ⅰ的结果显示,基因ITGA2B (P=0.0063)和GSN (P=0.019)在高骨密度组中的表达水平明显高于在低骨密度组中的表达水平。蛋白质-RNA整合分析显示,基因RHOA (P=0.00062)在高低骨密度人群中的表达水平也存在着显著的差异。基于多种生物信息学工具的网络结构和通路分析显示,以上三个显著差异表达的基因同时富集在两条重要的和骨代谢密切相关的通路中:“肌动蛋白细胞骨架调节(Regulation of actin cytoskeleton)” (P=0.000 011 3,FDR=0.000 334)和“白细胞跨内皮迁移(Leukocyte transendothelial migration) ”(P=0.000 276,FDR= 0.004 71),并各自在以上两条通路中发挥极其重要的作用。在研究Ⅱ中鉴定出在高低骨密度组之间存在显著表达差异的膜蛋白P4HB (P=0.002 1), CD36(P=0.010 4),ACTN1 (P=0.038 1)和 ITGB1 (P=0.038 5)。在后续的网络结构和通路分析中发现,这些膜蛋白在与骨代谢相关的通路“细胞外基质受体的相互作用(ECM-receptor interaction)”,“钙离子结合 Calcium ion binding) ”,“白细胞跨内皮迁移(Leukocyte transendothelial migration)”和“细胞质中钙离子水平调节(Reduction of cytosolic calcium levels) ”中扮演着重要的角色。本论文鉴定到的与骨质疏松密切相关的潜在风险基因和生物学通路将为今后骨质疏松的遗传机制研究、临床诊断和治疗、药物研发提供重要的参考。后续实验将开展针对鉴定到的风险基因的生物学功能研究,以寻求更多、更直接的证据。