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植物在受到胁迫时,体内H2O2水平增加,从而进一步介导信号转导过程,其中活性氧(ROS)的积累还能够使MAPK得到激活。WRKY作为一种转录因子在各种生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要的作用,其在抗氧化防护方面的研究还比较少。本实验以玉米为研究对象,利用基因表达分析、酶活测定等方法,结合原生质体瞬时表达、酵母双杂交和双分子荧光互补实验(BiFC)等手段,研究了ZmWRKY4与抗氧化防护的关系及其与ZmMPK5的相互作用。
通过不同浓度的镉(Cadmium,Cd)处理玉米植株,观察抗氧化酶的活性变化,并观察抗氧化酶基因及ZmWRKY4基因的表达情况,结果显示,Cd诱导下,8小时的时候抗氧化酶酶活达到一个高峰,而各抗氧化酶基因和ZmWRKY4基因的表达量都有所上升。
以玉米叶片RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增ZmWRKY4完整的基因编码区。并将ZmWRKY4全长基因构建到原生质体瞬时表达载体pXZP008上,得到重组表达载体pXZP008-ZmWRKY4,将重组载体pXZP008-ZmWRKY4用PEG融合法转化玉米原生质体。以黄色荧光蛋白YFP为报告基因,通过激光共聚焦扫描显微镜观察ZmWRKY4-YFP融合蛋白在细胞中的定位。结果表明:ZmWRKY4定位于细胞核。此外,在玉米原生质体中过表达ZmWRKY4后,抗氧化防护酶系统中SOD4和cAPX基因表达上调及SOD及APX酶活性增强。由此我们推测ZmWRKY4可能参与了抗氧化防护反应过程。
利用RNA干扰技术对ZmWRKY4进行基因沉默,抗氧化酶SOD,APX的总酶活及基因表达水平都降低了约一半,经恢复处理后,两者的酶活都略有增强,基因表达水平恢复到了对照的水平,cAPX的基因表达甚至超过了对照。这些实验结果都进一步证明了ZmWRKY4参与了抗氧化防护过程。
已有研究报道,Cd能够诱导ZmMPK5的活化,而转录因子ZmWRKY4也能够被Cd诱导表达,ZmWRKY4作为一种转录因子极有可能与ZmMPK5存在作用关系。最终,我们通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验(BiFC)确证了两者之间确实存在着相互作用。