水稻白叶枯病菌是一种能够引起水稻细菌性灾害的革兰氏阴性细菌。研究发现,白叶枯病菌PXO₀3968编码蛋白质在成熟的过程中需要蛋白酶的酶切作用,其产物17肽在白叶枯病菌中高度保守。为寻找PXO₀3968编码蛋白质成熟相关蛋白酶,我们主要进行一下几个部分的工作：基于FRET现象构建蛋白酶检测器；白叶枯病菌（PX099）胞外蛋白酶初步分离分析；预测蛋白酶的克隆表达及纯化。蛋白酶,又称为蛋白水解酶。蛋白酶参与了生物体的多种代谢过程：调节蛋白质的定位与活性、调节蛋白质-蛋白质相互作用、参与胞内信分子信号传导,以及新生物活性分子的生成等。对于蛋白酶活性的生化分析方法可分为两类：均相检测和分离型检测。在均相检测中无需进行进一步的分离即可在反应混合液中检测到底物或者产物信号的变化；在分离型检测中,停止酶反应后的反应混合物中产物以及残余底物需要经进一步的分离来检测分析酶活。均相检测中主要是应用荧光标记技术检测蛋白酶活性。目前广泛应用的四种方法为：以酰胺键连接的多肽和荧光基团为底物；以发生荧光共振能量转移的一对荧光蛋白为底物；以发生荧光淬灭的一对荧光蛋白为底物；检测酶切前后的荧光偏振强度。分离型检测反应中,底物与产物通过合适方法进行分离,然后进行检测和定量。根据已知的PXO?₀3968编码序列,利用PCR方法将PXO₀3968构建到CFP和YFP蛋白之间,在大肠杆菌中超表达并纯化此融合蛋白,所得目的蛋白为包涵体,复性困难。且在目的蛋白中并没有预期的FRET现象,可能是由于CFP和YFP蛋白之间的距离超出FRET所需的极限距离。根据预测的酶切位点序列,将预测酶切位点（EGDYVRTP/TDGRDADG）构建到CFP和YFP蛋白,最终获得目的蛋白质具有明显的FRET现象,以此蛋白作为蛋白酶检测器。并利用pMal-c2e载体克隆表达可溶性PXO₀3968蛋白。通过超滤等浓缩方法处理PX099细菌培养液,获得粗分离的蛋白酶混合物。通过蛋白酶检测器的检测,发现大于30KDa的组分能够使蛋白酶检测器的FRET现象消失。表明在大于30KDa的蛋白质混合物中存在一种或者几种能够在特定位点对EGDYVRTP/TDGRDADG进行切割的蛋白酶。将大于30KDa的组分经过质谱分析,所得结果与数据库比对,给出390种可能蛋白质。分析其中的蛋白酶,发现蛋白酶YP001914183.1；YP₀01914215.1;YP₀01916133.1; YP₀01911256.1; YP₀01911714.1。克隆并原核表达这些蛋白质,最终只获得可溶的蛋白酶周质蛋白酶（YP001914215.1：periplasmic protease）,并发现周质蛋白酶能够断裂PXO₀3968蛋白质,将所断裂位点进行蛋白质N端测序,所断裂部位为（AENLSYN/FVEGDYVRTP）。以上工作的完成为进一步分析PXO₀3968其功能奠定了基础。