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目的:针对DNA/RNA上胞嘧啶5位甲基化及其氧化衍生物修饰建立高灵敏度的化学标记结合LC-MS（liquid chromatography-mass spectrometry,液相色谱-质谱联用）,的分析方法,应用该方法进行HIV-1病毒感染与不感染THP-1细胞和TZM-bl细胞胞内DNA/RNA胞嘧啶5位甲基化及其氧化衍生物修饰的定性定量分析,为后续进一步研究表观遗传修饰在HIV-1病毒感染细胞中的影响和作用打下基础。方法:我们选用BDEPE（2-Bromo-1-（4-diethylaminophenyl）-ethanone,2-溴-1-（4-二乙氨基-苯基）-乙酮）作为衍生化试剂对DNA/RNA胞嘧啶5位甲基化及其氧化衍生物修饰进行标记,提高目标分析物在质谱检测中的响应,从而对感染与不感染HIV-1病毒的细胞胞嘧啶修饰变化进行定性定量分析。首先,我们以5-md C（5-methyl-deoxycytidine,5-甲基脱氧胞苷）、5-mr C（5-methylcytidine,5-甲基非脱氧胞苷）和5-mr Cm（2-O-methyl-5-methylcytidine,2-氧甲基-5-甲基非脱氧胞苷）的标准品作为修饰代表与BDEPE进行衍生化反应条件的逐一优化,得到最合适的反应条件。同时优化检测目标物标记产物的液相色谱条件和质谱条件,建立针对胞嘧啶修饰的化学标记结合LC-MS的高灵敏的分析方法。然后建立HIV-1IIIB-TZM-bl细胞感染模型和HIV-1 Bal-THP-1细胞感染模型,在HIV-1病毒感染细胞3天后收集细胞样本,采用Trizol法分别提取细胞内的总DNA和总RNA,然后取一定量的DNA和RNA酶解成核苷,通过GCB-SPE（graphitized carbon black-solid phase extraction,石墨化炭黑-固相萃取）的方法对酶解后的样品进行除盐后,分别将其和衍生化试剂BDEPE进行衍生反应,最后运用UPLC-QTOF（Ultra high performance liquid chromatography-Quadrupole Time-of-Flight,超高效液相色谱-四极杆飞行时间）和UPLC-Qq Q（Ultra high performance liquid chromatography-Triple quadrupole mass spectrometry,超高效液相色谱-三重四级杆液质联用仪）对这两个细胞模型的样品进行DNA和RNA胞嘧啶甲基化及其氧化衍生物修饰的高灵敏的定性和定量检测分析。最后使用统计学方法T检验分析比较HIV-1病毒感染细胞前后胞嘧啶各修饰含量的变化。结果:1化学标记结合LC-MS分析方法的建立结果:1.1衍生化试剂BDEPE和DNA/RNA修饰核苷的最优反应条件为:200μL的ACN（acetonitrile,乙腈）反应体系中含有2m M衍生化试剂BDEPE、4m M催化剂TEA（triethylamine,三乙胺）以及反应底物,在60oC的反应温度下水浴反应6小时。衍生化反应转化率良好,各种修饰的转化率达90%以上,并且衍生化产物在反应后48小时内稳定。1.2 GCB-SPE除盐:DNA/RNA酶解为核苷后需要通过GCB-SPE除盐后方能与BDEPE进行衍生化标记反应。经过计算,目标物经过该法除盐后回收率达85%以上,说明目标物经过GCB-SPE的回收率良好。1.3液质方法:通过对比不同流动相条件我们选用0.1%的甲酸水溶液（v:v）和乙腈溶液作为色谱分离的流动相A相和B相。液相分离后,我们采用高分辨质谱的全扫描模式采集,获得目标物标记产物的精确分子量,通过与标准品标记产物的保留时间和精确分子量对比,对实际样品的目标物进行定性分析。再采用Qq Q的MRM模式对每个样本中的12个目标物的标记产物进行定量分析。1.4化学标记结合LC-MS分析方法检测:通过BDEPE衍生化标记,修饰核苷的液质检测的灵敏度提高了5-666倍,在没有进行衍生标记的细胞样本中只能检测到5-mr C、5-fr Cm和5-hmd C这3种含量较高的修饰,而衍生后可以在细胞样本中检测到12种目标修饰核苷。并且5-md C,5-hmr C,5-fd C、5-cad C、5-mr C和5-mr Cm在1/10~6-250/10~6（/10~6G）的范围内具有较好线性趋势,其相关系数（R）均高于0.99,因此我们可以对这几种修饰进行准确定量分析。2 HIV-1病毒感染细胞前后的胞嘧啶修饰的检测结果:2.1 HIV-1 Bal毒株感染THP-1细胞3天后的细胞内胞嘧啶及其氧化衍生物修饰结果显示:染毒组与对照组相比,大多数目标修饰物的含量呈不同程度降低,其中5-md C的含量从2.842个修饰/10~6d G降低至0.106个修饰/10~6d G,约降低了27倍;5-hmr Cm的含量从0.477个修饰/10~6r G降低至0.043个修饰/10~6r G,约降低了11倍。经T检验分析显示,染毒组与对照组相比,5-md C、5-hmd C、5-fd C、5-mr C、5-fr C、5-hmr Cm和5-fr Cm这7种修饰的下调具有统计学差异。2.2 HIV-1 IIIB毒株感染TZM-bl细胞3天后的细胞内胞嘧啶及其氧化衍生物修饰结果显示:染毒组与对照组相比,与THP-1细胞类似,大多数修饰的含量均呈不同程度的降低。经T检验分析显示,染毒组与对照组相比,5-md C、5-hmd C、5-hmr C、5-fr C、5-hmr Cm和5-fr Cm的含量变化具有统计学差异。结论:本研究建立了化学衍生标记结合LC-MS的检测方法,提高了质谱检测胞嘧啶修饰核苷的灵敏度,在细胞样品的DNA和RNA上同时检测了胞嘧啶的12种目标修饰物,并且该方法适合于不同来源生物样本的DNA和RNA胞嘧啶修饰的检测分析。运用该方法,我们对HIV-1病毒感染细胞的胞嘧啶5位甲基化及其氧化修饰进行了定量分析,通过染毒组与对照组中12种胞嘧啶修饰的含量的比较,发现HIV-1 IIIB和HIV-1 Bal毒株分别感染TZM-bl和THP-1细胞后,会引起细胞中DNA和RNA上的多数胞嘧啶修饰含量较不染毒发生显著性下调,说明HIV-1病毒感染会引起胞内胞嘧啶修饰水平的改变,而这些改变可能会影响相关基因的表达调控,为进一步探究胞嘧啶修饰在HIV-1病毒感染复制的过程中起着何种生理作用打下基础。