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错配修复是一种高度保守的DNA修复途径,在DNA复制、修复和基因重组过程中发挥着重要作用。在真核生物中,MutS识别DNA子链上的错配碱基并与之相结合,从而招募核酸内切酶MutL形成三元复合物。真核生物中包含三种MutL异二聚体复合物MutLα,MutLβ,和MutLγ。Mlh1是MutL核心亚基,MutL复合物不仅参与DNA错配修复（MMR）,而且在减数分裂基因重组中起到拆分异源双链DNA的作用。单细胞真核生物嗜热四膜虫包含两个细胞核,二倍体生殖小核（MIC）和多倍体体细胞核（MAC）。有性生殖过程中小核进行减数分裂,配子融合后经有丝分裂产生新大核和新小核并传递给后代。在减数分裂前期,DNA双链断裂（DSB）触发小核伸长,从而促进同源配对和交叉互换（CO）。新大核的基因组发育自合子核,但经历了内部序列删除（IES）和DNA多轮复制。前期我们的研究表明嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3参与调控基因组复制、染色体分离及DNA删除,然而MutL核心亚基Tmlh1在其中发挥的作用并不清楚。本研究首次围绕嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1进行研究,获得主要结果如下:1.TMLH1的鉴定和敲除突变体构建嗜热四膜虫错配修复蛋白TMLH1（TTHERM00127000）的基因全长4553 bp,开放阅读框2271 bp,编码756个氨基酸。TMLH1在四膜虫营养生长期和饥饿期低水平表达,在有性生殖2 h-4 h表达水平上调,然后下调,10 h后表达水平再次上调。构建了不同交配型的TMLH1敲除细胞株,突变体细胞增殖和传代时间延长。γ-H2A.X检测表明,突变体细胞DNA损伤修复效率降低。有性生殖配对率降低、发育过程迟缓且微核异常形成。结果表明,敲除TMLH1基因导致DNA损伤修复缺陷和基因组不稳定,影响细胞增殖和有性生殖起始。2.Tmlh1在嗜热四膜虫发育过程中具有不同的定位模式为研究四膜虫中Tmlh1蛋白的定位与功能,构建带有HA标签的Tmlh1过表达细胞株。免疫荧光定位显示,营养生长时期的小核具有强的定位信号,大核中存在微弱信号。在有性生殖前期,Tmlh1定位于生殖系小核及转录活跃的亲本大核。在核选择和anlagen时期,Tmlh1定位信号只存在于功能核上,并且从即将凋亡的小核和亲本大核上消失。在减数分裂和有丝分裂时期,Tmlh1同α-tubulin存在共定位,且形成纺锤丝结构;有性生殖后期,Tmlh1与Pdd1发生共定位,表明Tmlh1在四膜虫虫细胞发育的不同阶段具有多样化的功能。3.Tmlh1具有核酸内切酶活性Tmlh1蛋白N端（NTD;1-416）高度保守,包含保守ATP酶结构域;C端（CTD;492-756）相对保守,包含二聚体结合区S1 site、MIP盒因子结合位点S2 site、PCNA互作区PIP-box motif以及C末端同源基序CTH motif。Tmlh1结构模拟显示由柔性linker连接的NTD、CTD在空间上同MutL亚基形成二聚体复合物,呈现出MutL家族典型的哑铃状拓扑结构。优化密码子并合成TMLH1基因,构建重组质粒并经大肠杆菌表达,利用亲和层析柱纯化蛋白。酶切活性分析表明,体外条件下Tmlh1对ds DNA具有浓度依赖性、可被金属离子Cu2+刺激的独立核酸内切酶活性;ATP/ADP抑制该活性,并且金属离子的存在使抑制作用增强。4.Tmlh1互作因子分析为了研究嗜热四膜虫中Mlh3是否与Tmlh1形成功能性复合物MutLγ,我们分别用GST和6His-MBP标记Tmlh1与Mlh3,pull-down证明Tmlh1与Mlh3之间存在直接的相互作用,并且Tmlh1的C末端结构域可单独与Mlh3结合。进一步构建Tmlh1-ΔC10截短突变体。结果表明,CTH motif（残基746-756）的缺失导致Tmlh1蛋白稳定性降低,且影响了与Mlh3的相互作用。Tmlh1的CO-IP-MS结果显示,嗜热四膜虫体内存在多种Tmlh1互作因子,包括错配修复MutS家族蛋白,交叉互换因子Rad51、Dmc1,微管蛋白Atu1、Gtu1、新大核异染色质形成和组蛋白甲基转移酶Ezl1、染色质结构重塑因子Hmb1。综上所述,本研究首次鉴定出嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1,获得了TMLH1敲除突变体,免疫荧光定位发现Tmlh1具有多样化的定位模式。体外表达和纯化出Tmlh1蛋白,发现Tmlh1具有核酸内切酶活性。Tmlh1参与DNA同源重组、大核基因组重排及染色体的正确分离,从而维持四膜虫生长发育和有性生殖过程中基因组的稳定性。研究结果为进一步理解错配修复蛋白Mlh1在真核生物中的功能进化提供了重要理论基础。