目的:本研究目的在于应用原子力显微镜深入观察不同程度贫血患者口腔黏膜鳞状上皮细胞表面的细胞膜结构的改变,对细胞膜表面特性进行分析,探讨细胞表面膜结构的变化与人体健康状态的关系,为原子力显微镜的临床试验应用提供一定可供参考的实验依据。方法:1分组评判标准按血红蛋白浓度划分为4组:对照组:男性Hb:120~160g/L,女性(非妊娠)Hb:110~150g/L;轻度贫血组Hb:90~109g/L;中度贫血组Hb:60~89g/L;重度贫血组Hb:30~59g/L。2受检者纳入标准(1)年龄为20岁-35岁;(2)无口腔黏膜疾患病史;(3)口腔内无局部刺激因素;(4)全身无与放射性物质或有毒化学物质接触史;(5)无吸烟史;(6)均经过协商同意受检口腔黏膜鳞状上皮细胞。3 AFM标本的制备受检者按血红蛋白浓度划分为4组:即对照组、轻度贫血组、中度贫血组、重度贫血组,每组收集30例,每人2张细胞涂片样品,各样品选择5个细胞,每个细胞选择膜表面亮度变化较大的一个5μm区域,即每组共300个细胞数据。嘱受检者清洁口腔后,经过消毒的木质压舌板,轻刮取受检者口腔内侧颊黏膜。将第2次刮取物用2%甲醛溶液冲洗入5mL离心管内,固定约20 min。然后将离心管置于离心机,以1 000 r/ min离心10 min ,弃去上清液,重复1次。将细胞悬液轻轻涂于已经处理好的洁净载玻片上,置于超净工作台晾干备用。4 AFM操作方法本研究应用AFM在“tapping”(接触)模式,大气环境和室温条件下对人体口腔鳞状上皮细胞进行观察,描绘出样本表面原子级分辨率的三维图像。取晾干的样本切片轻放于AFM载物台上,选择分散比较均匀的细胞,置于视野中央接近探针的位置。手动调节扫描探头激光点,与针尖重合,保证激光光斑、屏幕中心圆点、探针尖三点重合。于每个涂片样本上扫描10个细胞,扫描范围500nm～90μm,扫描频率为0.5Hz和2Hz。选取5μm区域图像,利用最新版AFM图像分析软件Nanoscope5.31r1对图像进行处理分析,记录图像Hight(高度图)和Amplitude(振幅图)的Ra(平均粗糙度)2个参数的具体测量值,汇总。5所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料采用均数士标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1病理细胞学结果经武警总医院病理科两名病理诊断医师在光镜下检查各组口腔鳞状上皮细胞涂片,对照组口腔鳞状上皮细胞,与轻度贫血、中度贫血和重度贫血患者的口腔鳞状上皮细胞的HE染色结果,四幅图对照,并不能观察出明显的差异。2 AFM细胞扫描图应用原子力显微镜分别观察对照组和贫血组的口腔鳞状上皮细胞。对照组鳞状上皮细胞膜表面隆起光滑、饱满,排列疏密有度,各隆起间形成的缝隙状凹陷深度较为均匀;而轻度、中度、重度贫血组细胞表面隆起粗糙程度逐渐增加。重度贫血组患者的细胞则可观察到明显虫蚀样孔洞出现。对局部5μm图像中的高度图(Height)和振幅图(Amplitude)进行平滑度处理,分别得出平均粗糙度Ra值,轻度、中度、重度贫血组与对照组相比,Ra值明显增加。3统计学分析结果全部数据分为4个组:对照组、轻度贫血组、中度贫血组、重度贫血组,对高度图(Height)和振幅图(Amplitude)中的平均粗糙度Ra值和进行统计学分析,采用SPSS13.0软件进行处理。所有数据以均数±标准差((?)±s)的形式表示。对照组Ra值分别为18.8411±0.427,11.011±0.106;轻度贫血组39.4683±0.863,14.164±0.563;中度贫血组为67.5262±1.062,17.344±0.673;重度贫血组106.6947±1.915,22.984±0.763。四组细胞膜表面的平均粗糙度比较有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。结论:在原子力显微镜下,人体口腔黏膜鳞状上皮细胞的细胞膜表面结构,随着贫血程度的加深表现出不同程度的改变,细胞膜表面的平均粗糙度Ra值呈现增加的趋势。在重度贫血组的整个细胞的Height(高度图)上可以看到如虫蚀状的孔洞出现。初步观察出贫血在口腔鳞状上皮细胞的细胞膜表面结构上有所体现,平均粗糙度Ra值可以在一定程度上反映贫血的严重程度。