前言 1969年Walknowska等报道在孕妇外周血中发现了核型为46，XY的细胞，为无创性产前基因诊断研究开辟了新的道路。目前，对遗传性疾病的产前诊断，根据诊断方法是否对胎儿构成不良影响而分为有创性的和无创性的。有创性产前诊断包括绒毛活检、羊膜腔穿刺、胎儿宫内取血等，这些手段虽然诊断准确率较高，但对胎儿有一定的危害，且有导致孕妇发生流产的可能。而从孕妇外周血中富集、纯化胎儿细胞或游离DNA，用于产前诊断则属无创性的。由于其具有安全可靠，对母婴无损伤等优点，因此是产前基因诊断研究的必然趋势。它是以孕妇外周血为材料，获取其中微量的胎儿细胞，从而为遗传病的产前诊断提供可靠的胎儿基因组。随着研究的不断深入，学者们发现胎儿有核红细胞(Nucleates Red Bbod Cell，NRBC)是一种较理想的靶细胞。然而目前还存在两个主要问题：(1)靶细胞数目稀少，大约为母体有核细胞的1／10~4～10~6；(2)需要明确的标记检测细胞的胎儿源性。目前用于分离胎儿细胞的方法很多，如流式细胞仪分选和／或磁激活细胞分选法富集等，然而这些富集程序不可避免的导致细胞的丢失。因此准确获取胎儿有核红细胞，简化实验步骤，减少细胞的丢失是无创性产前基因诊断技术的关键。 Duchenne型肌营养不良症(DMD)，是一种严重致死性X连锁隐性遗传病，发病率约为1／3500活男婴，其临床表现以肌肉的进行性萎缩和无力为特征。患者多在3～5岁发病，20岁前死亡。Dystrophin基因定位于Xp21.1～21.3，它是目前已知的人类最大的基因，全长约为2.4Mb。DMD基因突变中以缺失最为常见，约占55％～65％，重复次之，约占6％。有两个缺失热区：即5’端的4～21外显子(占缺失的20％)；另一为第44～52外显子(占缺失的54％～60％)。应用2×9对引物的多重PCR方法能检测到98％的缺失。其他非缺失型可通过利用DMD基因上的一些短串联重复顺序(STR)进行连锁分析。由于目前尚无有效的治疗方法，唯一有效的预防途径是对高风险胎儿进行产前诊断，杜绝患儿的出生。因此探讨DMD的无创性产前基因诊断具有重大的社会和经济效益。实验材料与方法 40例受试者，妊娠7一26周，其中巧例为孕有杜氏肌营养不良(DMD)高风险患儿的孕妇。2例胎儿脐血做为阳性对照;3例正常未孕女性及3例正常男性做为阴性对照。 本实验以不连续密度梯度离心法富集孕妇外周血中的胎儿细胞，细胞涂片离心机制片，然后应用胎儿血红蛋白特异性抗体的免疫组化鉴定、识别胎儿有核红细胞，计数、定位，显微操作法获取HbF阳性细胞，对其进行全基因组扩增。在此基础上，进行性别、多重PCR及STR连锁分析检测，进一步验证有核红细胞的来源，并同时完成DMD的无创性产前基因诊断。实验结果 经免疫组化能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，最适孕周为孕14一18周。40例孕妇中，37例检出有HbF阳性细胞，其余3例未检出。检出数量从2.5/10耐一17.14个/10血不等，平均为9.巧个/10而。另外3例正常未孕女性及3例正常男性的外周血中均未检出有NRBC。巧例孕有DMD高危患儿的孕妇中共检出9例男性胎儿，6例女性胎儿，应用多重PCR方法，对先征者及有核红细胞进行遗传学分析(绒毛或羊水作为对照)，其中5例标本的DMD基因经外显子检测，发现存在缺失，结果与绒毛/羊水对照一致，诊断为DMD男性患儿。另10例标本经外显子检测未发现缺失，进一步经STR连锁分析，其中l例诊断为男性患儿，3例正常男性胎JL;3例诊断为女性携带者，3例正常女性胎儿。结论 1.首次应用胎儿血红蛋白特异性抗体(HbF，链)标记、识别胎儿NR-BC，建立了胎儿NRBC识别与分离一步完成的新技术。 2.经免疫组化能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，且以孕14一18周分离效果最好。 3.本研究进一步完善了全基因组扩增技术，通过获取几个细胞进行PEP扩增弥补了由于单细胞全基因组扩增可能产生的等位基因丢失和假阳性扩增现象，提高了基因诊断的准确率。 4.联合性别检测、多重PCR和grR连锁分析并结合上述识别方法，进一步验证有核红细胞的来源，并完善了DMD的无创性产前基因诊断方法。