本研究采用与成肌细胞共同培养的方式，模拟体内的成肌微环境，促进MSCs的成肌分化及其移植效率的提高。通过移植共同培养后的细胞，寻找提高MSCs移植效率的新途径，为将来的临床应用奠定理论基础。同时，初步研究在共同培养条件下，成肌细胞促进MSCs成肌性分化的可能机制。 1.材料和方法1.1实验动物SD大鼠作为MSCs供体鼠，正常野生型C57鼠作为正常对照，未经移植的mdx鼠作为阴性对照，将mdx鼠下肢肌肉(胫前肌和腓肠肌)的左右侧分别作为共同培养组和单独培养组细胞局部注射移植处。选取6-8周龄的mdx鼠进行移植，分别于移植后2、4、8、12和16周取材。在细胞移植过程中死亡的mdx鼠退出试验，保持各组和各时间点动物为3只左右。 1.2MSCs、HEK293细胞和C2C12成肌细胞的培养取SD大鼠骨髓做原代培养，再用差速贴壁法分离、扩增及纯化MSCs，再用流式细胞仪(FCM)进行表面抗原鉴定，将形态一致的P4-6代MSCs用于移植。当293细胞生长至70～80％融合时，可用于Ad-eGFP的扩增。C2C12成肌细胞生长至70～80％融合时，可传代或用于共同培养。 1.3Ad-eGFP的扩增、纯化、鉴定和转染 当接种过构建有增强型绿色荧光蛋白腺病毒(Ad-eGFP)的293细胞出现病变效应(CPE)后，可以收获病毒。用CsCl2梯度离心法纯化病毒，用TCID50检测方法测定病毒滴度。提取病毒DNA，进行E2b区的PCR检测。按照感染复数的不同分别接种相应剂量的Ad-eGFP，用FCM检测转染效率。 1.4MSCs和C2C12成肌细胞的共同培养 将转染eGFP后的MSCs与C2C12成肌细胞按照10∶1的比例接种，用含有2％马血清的DMEM培养。 1.5诱导分化后MSCs中成肌调节因子表达的RT-PCR、WesternBlot和免疫荧光检测 分别选取诱导分化后第1、3、5和7天的共同培养组和单独培养组细胞，做MyoD和Myogenin表达的RT-PCR、WesternBlot和免疫荧光检测，并比较两组之间的统计学差异。 1.6诱导分化后MSCs胞浆中钙离子浓度变化的激光共聚焦检测分别选取诱导分化后48h的共同培养组和单独培养组的MSCs，用Fluo3标记钙离子，用激光共聚焦显微镜先扫描得到基线荧光强度之后，再添加nicotine，继续检测细胞内荧光强度的变化。 1.7将mdx鼠预先放疗后进行局部肌肉注射性的细胞移植首先预先放疗mdx鼠，再将共同培养组和单独培养组细胞分别多点注射注射到mdx鼠的单侧肌肉(胫前肌和腓肠肌)，注射总量为0.4ml，移植细胞总数约为1×106个。 1.8肌肉组织HE染色分别选取移植后2，4，8，12和16周的共同培养组和单独培养组肌肉的冰冻切片进行常规HE染色，在镜下观察细胞形态，并计算细胞核中心移位肌纤维的比例。 1.9移植后肌肉中成肌调节因子和相关蛋白表达的RT-PCR、WesternBlot和免疫荧光检测 分别选取移植共同培养组和单独培养组细胞后第2、4、8、12和16周的肌肉，进行成肌调节因子和相关蛋白表达的RT-PCR、WesternBlot和免疫荧光检测，并比较两组之间的统计学差异。 1.10统计学分析所有统计学数据采用SPSS11.0进行分析，差异在统计学上有显著性意义的水平为P＜0.05。 2.结果2.1MSCs、HEK293细胞和C2C12成肌细胞的形态学和生长特点MSCs为贴壁性的细胞，经传代3代以上趋于纯化，多数呈均一典型的纺锤状成纤维样细胞形态。经FCM检测，其中CD11b和CD45表达阴性，而CD29和CD44表达阳性。HEK293细胞呈现出上皮样贴壁生长，生长迅速。C2C12成肌细胞表现为成纤维细胞样生长，在使用诱导分化培养基以后，生长减慢，开始分化，并表达成肌调节因子。 2.2Ad-eGFP扩增、鉴定并转染MSCsAd-eGFP在转染293细胞36-48h出现CPE，表现为：90％以上的细胞肿胀变圆并离散，部分聚集呈葡萄状，10～20％的细胞漂浮。提取病毒DNA，进行E2b区的PCR鉴定，得到一条861bp的产物，提示腺病毒结构完整。当MOI分别为10、20、50、100、150、200、300、400和500的时候，经FCM检测，相应的转染率依次为48.7、64.8、72.1、89.1、89.9、93.1、94.4、95.8和96.8(％)，MOI从10-100时候，转染率增加最显著，随后尽管大幅度增加病毒的剂量，但其转染效率不再明显增加，同时细胞病变明显，脱落细胞增多，因此在本研究中，以100作为最佳的MOI来感染MSCs。在转染24h后，eGFP的表达最为稳定。 2.3诱导分化后MSCs中成肌调节因子表达的RT-PCR检测在共同培养组中，MyoD于第3天表达量最高，在单独培养组中，于第1和第3天表达量相对较高。两组均在第5天时显著下降，至第7天时仅有少量表达。在两组细胞中，Myogenin的表达量在第1和第3天都很少，在第5天显著提高，在第7天时下降。两组之间表达量的差别在统计学上有显著性意义。 2.4诱导分化后MSCs中成肌调节因子表达的WesternBlot检测在两组中，MyoD的表达均于第3和第5天达到高峰。Myogenin的表达均于第1天开始就逐渐升高，在第5和第7天时达到高峰。两组之间表达量的差别在统计学上有显著性意义。 2.5诱导分化后MSCs中成肌调节因子表达的免疫荧光检测将两组MSCs诱导分化至第3天，分别计算MyoD和Myogenin表达的阳性率。前者在共同培养组为11.8％，单独培养组为2.7％。后者在共同培养组5.4％，单独培养组为3.3％。 2.6诱导分化后MSCs胞浆中钙离子浓度变化的激光共聚焦检测在先后加入10μl和50μl浓度为1M烟碱后，两组细胞内标记钙离子的荧光信号强度开始不同程度的升高(但也有个别细胞表现为下降)，然后呈现为缓慢下降的趋势。其中在加入10μl的时候，荧光信号强度在两组之间的差别在统计学上有显著性差异。而在第2次加50μl的烟碱后，上述差别在统计学上无显著性差异。2.7肌肉的组织病理 正常C57鼠肌肉细胞呈多角形，形态基本一致，轮廓清晰、完整，肌细胞核位于细胞周边，未见有胞核中移现象，无炎性细胞浸润；肌纤维间隙正常，肌内束、肌间束结构完整。在移植后mdx鼠的肌肉中，均有较多的炎性细胞浸润，肌细胞横截面积大小不一，有萎缩和肥大细胞，肌细胞失去多角形形态，变成圆形，脂肪和纤维组织浸润不明显，而肌细胞核中心移位明显，但同时有少量的新生肌纤维的再生。未治疗组mdx鼠CNF可达60％，在移植后2、4、8、12和16周后，共同培养组分别为56.7、52.1、50.3、45.6和41.6(％)，而单独培养组分别为57.1、55.6、52.1、50.3和45.5(％)。 2.8移植后mdx鼠肌肉中成肌调节因子表达的RT-PCR检测在mdx鼠中有MyoD和Myogenin的少量表达，二者随着移植时间延长表达量逐渐增多，在移植后第8周表达量最高，然后缓慢下降。两组之间的差别在统计学上有显著性意义。 2.9移植后mdx鼠肌肉中成肌调节因子表达的WesternBlot检测MyoD和Myogenin的表达均随移植时间延长而逐渐增多，前者在移植后第8周，后者在第12周表达量最多，16周时仍持续表达。两组之间的差别在统计学上有显著性意义。 2.10移植后mdx鼠肌肉中成肌调节因子及相关蛋白表达的免疫荧光检测MyoD在正常C57鼠中没有表达，未治疗mdx鼠的阳性率为5％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培养组分别为6、12、20、15和10(％)，单独培养组分别为6、10、15、12和8(％)。Myogenin在正常C57鼠没有表达，未治疗mdx鼠的阳性率为7％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培养组分别为8、15、23、18和15(％)，单独培养组分别为7、10、18、15和10(％)。MHC在正常C57鼠肌细胞无表达，未治疗mdx鼠的阳性细胞比例小于1％；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培养组分别为5、15、18、23和20(％)，单独培养组分别为3、10、15、18和15(％)。mdx鼠肌肉细胞膜上基本无dystrophin表达；在移植后的2、4、8、12和16周，共同培养组分别为3、5、9、13和17(％)，单独培养组分别为2、4、7、12和15(％)。 3.结论3.1构建有增强型绿色荧光蛋白的腺病毒可以有效转染骨髓间充质干细胞，在后者的成肌分化过程中起到示踪的作用。 3.2与成肌细胞共同培养的骨髓间充质干细胞可以高效表达成肌调节因子；提示共同培养中的成肌细胞可以在一定程度上构建成肌微环境，加速骨髓间充质干细胞的定向分化。 3.3共同培养和单独培养的骨髓间充质干细胞分别移植mdx鼠后，成肌调节因子在前者中的表达要优于后者；提示在共同培养条件下，成肌细胞可以改善骨髓间充质干细胞的治疗效果。 3.4激光共聚焦显微术证实分化后的骨髓间充质干细胞对N型乙酰胆碱受体的特异性激动剂有明确的生理反应，并且共同培养组要优于单独培养组；提示N型乙酰胆碱受体可能在骨髓间充质干细胞的成肌分化中发挥着重要的生理功能，并随着其成肌分化程度的提高而加强。