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背景:恶性肿瘤的发病机制复杂多样,越来越多的研究结果发现恶性肿瘤的发生与细胞周期调控机制紊乱和细胞分化过程受阻有关,探讨肝癌的发病机制和治疗,有利于减低患者的病死率和提高患者的生存质量。本课题以人肝癌BEL—7402细胞为研究对象,研究蛋白酶体抑制剂MG132抑制蛋白酶体通路后,从基因和蛋白水平上对Cks1、P27蛋白表达的影响,初步探讨蛋白酶体抑制剂抗肝癌细胞增殖和凋亡的作用机制。目的:研究蛋白酶体抑制剂MG-132对人肝癌BEL—7402细胞增殖、凋亡的作用,并观察MG-132对人肝癌BEL—7402细胞中Cks1、P27表达的影响。方法:体外培养人肝癌细胞系BEL—7402细胞,实验组MG-132终浓度设定为1、2.5、5.0、10.0、20.0umol/L,和以终浓度为5.0 umol/L的MG132作用不同时间为实验组,未加MG-132组为对照组,采用对数生长期的细胞进行实验。(1)MTT法测定细胞的生长抑制率;(2)倒置显微镜观察活细胞生长情况并摄片;Hoechst33258染色观察细胞核变化;(3)流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期;(4)采用实时荧光定量PCR方法检测Cks1、P27mRNA的表达。(5)采用Western-Blot分析Cks1、P27蛋白的表达。结果:(1)1—20.0umol/L的MGl32对BEL-7402细胞均有抑制作用,抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强。(2)倒置显微镜下观察到药物作用后凋亡细胞明显增多,凋亡细胞形态为:细胞缩小变圆,细胞膜出泡等。细胞Hoechst33258染色细胞核出现核浓缩、碎裂等凋亡特征。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡率随MG-132浓度增加而增高,随药物作用时间延长而升高;细胞周期随MG-132浓度增加和作用时间延长,G2/M期阻滞明显。(4)采用实时荧光定量PCR方法检测不同浓度组、不同时间段Cks1、P27mRNA的表达,差别无统计学意义,基因表达无显著变化。(5)采用Western-Blot分析不同浓度组和不同时间段Cks1、P27蛋白的表达与对照组相比,差别有统计学意义,蛋白表达水平有变化。结论:蛋白酶体抑制剂MG132能有效抑制人肝癌BEL-7402细胞增殖并将细胞阻滞在G2/M期,促进细胞发生凋亡,并且呈现一定的时间、剂量依赖性。MG132作用后导致周期蛋白的变化可能是在翻译水平后发生。MG132小剂量长时间作用能够在蛋白水平增强Cks1、P27蛋白的表达,其作用可能与泛素蛋白酶体途径被抑制有关。MG132抑制细胞增殖并促进细胞凋亡的作用可能与MG132上调Cks1、P27蛋白表达有关,须进一步证实。