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目的:通过体外单独染氡、香烟及联合染毒诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化,建立恶性转化细胞模型。通过检测细胞恶性转化过程中甲基化转移酶基因m RNA表达以及全基因组甲基化水平的改变,以及利用高通量甲基化芯片筛选单独及联合染毒发生DNA启动子区域异常甲基化的特异基因,探索氡、香烟联合致肺癌的机制,为氡、香烟联合致肺癌的防治提供理论依据。方法:将处于对数生长期的BEAS-2B细胞以1.5×105个接种于0.4μm Transwell膜中,细胞贴壁后将Transwell膜置于染毒腔内,毒气持续泵入在膜上方直接与细胞接触染毒,氧气浓度恒定于21%,水浴维持染毒腔温度在37℃,每次同时染毒3个。实验设对照组C、氡气染毒组Rn、香烟烟雾染毒组Sm和联合染毒组RS。使用CCK-8试剂盒检测不同氡、香烟染毒浓度后细胞存活率,确定合适的单独及联合染毒剂量。染氡两次后将Transwell膜中细胞消化,置于培养瓶中常规培养,待生长至对数生长期后进行下一代染氡,共染毒15代。对照组暴露于浓度为空气本底值的相同装置中,其余条件同染毒组。完成15代染毒并传代至20代后,流式细胞仪分析细胞周期、凋亡变化,软琼脂分析克隆形成,酶标仪检测全基因组甲基化水平,荧光定量PCR检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因m RNA表达情况。Illumina450k甲基化芯片筛选单独及联合染毒发生异常甲基化的特异基因,并检测SPDEF、CDK5RAP1、PTPRM和ABCG1基因m RNA表达情况。结果:(1)细胞恶性转化模型的建立。在染毒时间相同条件下,随染毒剂量升高,细胞存活率逐渐下降;氡、烟联合染毒CI值<1,提示二者具有协同效应;确定氡染毒浓度和时间为20000Bq/m3,30min;香烟烟雾染毒浓度和时间分别为20%,10min。细胞周期显示染毒15代传代20代的细胞G1期明显缩短,S期明显延长,联合染毒组细胞S期延长最为明显,表明细胞处于增殖旺盛状态,其周期发生一定程度的失控,同时细胞凋亡率明显降低,呈现凋亡抑制状态。与对照组相比,染毒15代传代20代细胞软琼脂克隆形成能力已明显形成,联合染毒组细胞软琼脂克隆形成率已达到24.00±0.31(P<0.05)。(2)全基因组甲基化水平及甲基化水平的改变:与对照组相比,单独及联合染毒组全基因组甲基化水平呈下降趋势,染毒15代传代20代细胞甲基化水平降至最低;染毒组细胞DNMT1基因表达明显降低,DNMT3A,DNMT3B基因表达明显升高,表明染毒后BEAS-2B细胞在发生了全基因组低甲基化的同时伴有部分CPG岛的高甲基化。(3)甲基化芯片筛选氡、烟单独及联合染毒特异性基因:利用Illumina450k甲基化芯片对Rn15-20,Rs15-20,Sm15-20进行检测,筛选出SPDEF,CDK5RAP1,PTPRM,ABCG1基因。联合染毒组异常甲基化基因CDK5RAP1,在细胞的周期与凋亡调控中占据重要地位;单独染氡组异常甲基化基因ABCG1,负责调控细胞内胆固醇的动态平衡;单独染烟组异常甲基化基因PTPRM,参与内皮细胞增殖负调节,内皮细胞迁移的负调控;氡、烟单独染毒组交集基因SPDEF,介导细胞增殖、分化和恶性变。对筛选基因m RNA表达情况进行进一步检测与分析,发现与对照组相比,联合染毒组CDK5RAP1 m RNA表达降低明显;单独染毒组SPDEF m RNA表达升高明显;氡染毒组ABCG1 m RNA表达升高明显;烟染毒组PTPRM m RNA表达降低明显(P<0.05)。结论:1.建立了体外染氡、烟联合染毒诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型,且氡、烟具有协同效应。2.恶性转化过程中,DNA甲基化转移酶m RNA表达发生改变,且全基因组甲基化水平降低。3.氡、烟单独及联合染毒发生异常甲基化的基因可能是单独及联合染毒致BEAS-2B细胞恶性转化的不同作用机制。