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第一部分：骨髓间充质干细胞治疗大鼠肾脏缺血/再灌注损伤的最佳途径及最佳剂量的研究背景：骨髓间充质于细胞(MSC)治疗对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤(I/R)有潜在修复作用,输注后归巢率低等因素限制了其功能的发挥。已有研究证实,细胞的输注途径在一定程度上能影响MSC的归巢率。目前常用的输注途径为尾静脉和颈动脉。本研究采用肾动脉直接注射途径,并比较MSC不同输注途径和不同输注剂量对细胞肾脏归巢率的影响以及对损伤肾脏的修复作用,进而探讨MSC治疗肾脏I/R损伤的最佳途径和剂量。方法：实验采用8-9周龄的雄性SD大鼠。通过切除右侧肾脏后,立即用无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂45分钟后再开放的方法建立大鼠肾脏I/R模型。恢复再灌注后,将大鼠随机分为干预组(n=60)和对照组(n=6)。干预组根据MSC的输注途径不同,分为尾静脉(TV)组,颈动脉(CA)组和肾动脉(RA)组。根据MSC输注剂量不同,将上述3小组再次分为10个亚小组(n=6/亚小组)：(1)TV组：1×106；(2)CA组：1×106,5×105,1×105和5×104；(3)RA组：1×106,5×105,1×105,5x104和PBS。CM-Dil标记的MSC细胞重悬于500μl的PBS中,于恢复再灌注1小时内缓慢输入体内。再灌注后1小时和24小时,彩色多普勒超声评估肾脏血流。以再灌注后24小时为时间点,处死大鼠并留取相应的标本：检测血清肌酐水平(Scr)以评估肾功能；肾组织切片进行HE染色评估肾脏损伤病理评分；荧光显微镜和共聚焦显微镜观察输注MSC在肾脏及其他脏器的定植情况。结果：(1)再灌注后24小时,对照组的肾脏损伤严重：病理评分达3.30±0.65；Scr为5.22±0.43mg/dl,明显高于正常组(0.92±0.14mg/dl,P<0.05)。输注相同剂量的MSC(1×106)后,CA组的MSC均匀分布在全身多个脏器且对损伤肾脏的修复作用最明显：与对照组相比,Scr降至4.48±0.95mg/dl(P<0.05),肾脏病理评分降至2.85±0.76(P<0.05)。TV组的MSC主要阻断在肺,肾脏的归巢数量较少；Scr和病理评分较对照组减低,但两组之间差异不显著。在RA组,输注的MSC绝大多数定植在肾脏且肾脏中的归巢远远高于TV组和CA组,但是肾功能却较对照组进一步恶化(Scr,6.51±0.58mg/dl)。(2)当输注MSC细胞在5×104-1x106之间时,比较CA组各亚组发现,细胞数量与治疗效果成正比,最佳治疗组在CA组(1×106)；比较RA组各亚组发现,输注MSC的细胞数量与治疗效能成U型分布,最佳治疗效果在RA组(1×105)：Scr为3.71±0.96mg/dl,病理评分为2.65±0.56且RA组的最佳治疗组-RA组(1×105)治疗效能更优于CA组的最佳治疗组-CA组(1×106)。(3)共聚焦显微镜和荧光显微镜检查发现在RA组(1×106),大量MSC堆积在肾小球内；随着细胞剂量下降,MSC在肾脏定植量也降低。超声检查发现肾小球内定植的细胞量与肾脏血流灌注呈正相关：输注过量细胞会堵塞肾小球,导致肾脏低灌注。结论：细胞输注途径和剂量是影响MSC治疗I/R效能的重要因素。本研究得出,经肾动脉注射MSC是提高输注MSC归巢的最佳输注途径,1×105是肾动脉注射。的最佳治疗剂量。该组合既能改善疗效,又可节省干细胞。过多的细胞输注会影响肾脏血流,加重肾脏损伤。第二部分：阿托伐他汀联合骨髓间充质干细胞输注对大鼠肾脏缺血／再灌注损伤的作用及机制研究背景：肾脏缺血/再灌注损伤(I/R)后,肾组织内存在严重的炎症反应等肾脏微环境障碍。这是导致移植的骨髓问充质干细胞(MSC)存活率低的重要原因,也极大地降低了MSC对肾脏I/R损伤的治疗作用。已有研究证明,他汀类药物能改善肾脏I/R损伤后的内部微环境。本研究旨在观察阿托伐他汀(Ator)联合MSC输注对肾脏I/R损伤的作用并探讨其可能机制。方法：7-8周龄的雄性SD大鼠48只。通过夹闭双侧肾蒂45分钟后再开放的方法建立大鼠肾脏I/R模型。恢复再灌注后,即刻通过左颈动脉给动物模型输注CM-Dil标记的MSC (1×106/500μl PBS)或单纯PBS。以再灌注后24小时和72小时作为时间点,处死大鼠并留取相应标本。上述动物均于术前3天给予200μlAtor灌胃治疗(5mg/kg/d,n=24)或等量PBS(n=24),且灌胃治疗持续到上述时间点。根据动物是否接受Ator灌胃治疗和MSC输注治疗分为四组(n=6/组/时间点)：对照组,Ator组,MSC组和Ator+MSC组。检测血清肌酐水平(Scr),血清尿素氮水平(BUN)以评估肾功能；肾组织切片进行HE染色评估肾脏损伤病理评分；TUNEL检测细胞凋亡情况；免疫组化检测肾组织中Ki-67的表达以明确肾小管增生情况；ELISA检测肾组织中TNF-α、IL-1β和IL-10的表达以评估炎症反应,检测肾组织中MPO、SOD、MDA和GSH的含量评估氧化应激损伤；共聚焦显微镜观察输注MSC在肾脏的存活率；Western blot检测凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)、Toll样受体4(TLR4)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达。结果：(1)再灌注后24小时,MSC组Scr、BUN以及肾脏病理评分均显著低于对照组(P<0.05)；与MSC组相比,Ator+MSC组能进一步降低Scr、BUN和损伤评分(P<0.05)。再灌注后24小时,TUNEL检测发现MSC组的肾小管上皮细胞凋亡较对照组减少；Ator+MSC组比MSC组更显著地抑制凋亡(P<0.05)。Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡相关蛋白Bax的表达情况两组间的比较与TUNEL结果类似。再灌注后72小时,MSC组的肾小管上皮细胞增生较对照组明显增加；Ator+MSC组比MSC组更有效地促进细胞增殖(P<0.05)。(2)再灌注后24小时,免疫荧光检测显示Ator+MSC组肾脏组织切片中CM-Dil阳性细胞数量显著高于MSC组(32.33±3.51 vs.22.67±3.79,P<0.05)。ELISA检测显示Ator+MSC组IGF-1的表达水平显著高于MSC组(P<0.05),VEGFHGF表达也呈现上调的趋势。(3)与非Ator处理组(对照组和MSC组)比较,Ator处理组(Ator组HAtor+MSC组)的促炎因子表达下降(TNF-a:3020.53±907.78 vs.4020.95±1207.28, P<0.05;IL-1β:985.74±207.19 vs.1210.29±307.79, P<0.05),抗炎因子表达增加(IL-10: 542.23±91.25 vs.402.2872.07,P<0.05)。检测氧化应激相关的指标(MPO、SOD、 MDA和GSH)发现,Ator处理组的MPO活性和MDA浓度较非Ator处理组显著减少(P<0.05),GSH水平显著上升(P<0.05)。Western blot检测发现Ator处理组的肾脏组织中TLR4和HMGB 1的表达较非Ator处理组显著减少(P<0.05)。结论：Ator预处理能有效减轻肾脏I/R损伤,降低肾脏内部的氧化应激和炎症反应,其保护机制可能与TLR4-HMGB1信号通路有关。Ator+MSC联合治疗优于Ator或MSC单药治疗可能与Ator预处理改善了肾脏微环境,从而为移植的MSC创造了良好的生存条件,进而提高MSC的在体生存率、增强其疗效。