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目的:研究PM2.5有机提取物暴露对小鼠畸胎瘤干细胞P19心肌分化过程的干扰作用,旨在揭示PM2.5有机提取物产生心肌分化毒性的机制。方法:1.MTT法筛选出PM2.5无细胞毒性剂量MTT细胞毒性试验设置剂量梯度设置为0 mg/L,1 mg/L,10 mg/L,100mg/L,同时设置阳性对照组0.5%TritonX100,选择非细胞毒性的剂量进行后续研究。2.建立P19小鼠畸胎瘤干细胞体外心肌分化模型P19小鼠畸胎瘤干细胞体外心肌分化模型模拟体内胚胎心脏发育过程,整个过程分为四个时期:未分化时期、心肌中胚层时期、心肌祖细胞期、和成熟心肌期,1%DMSO悬浮培养诱导拟胚体形成后进行贴壁培养,分化过程共持续14天。3.未分化P19细胞暴露非细胞毒性剂量（10 mg/L）PM2.5.5 48 h对分化进程的干扰作用显微镜下观察分化各时期形态学变化,实时荧光定量PCR技术检测不同分化时期特异性标志物的表达,免疫荧光及流式细胞术检测分化末期成熟心肌细胞功能性蛋白cTNT的表达情况,判断未分化时期暴露PM2.5对整个分化进程的干扰作用及对干细胞心肌定向分化效率的影响。4.未分化P19细胞暴露非细胞毒性剂量（10 mg/L）PM2.5.5 48 h产生心肌分化毒性的可能机制免疫荧光技术检测γ-H2a.X分布,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Edu法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布情况。免疫荧光技术检测AHR及β-catenin分布情况。设置对照组（DMSO）、PM2.5处理组、PM2.5+CH2组及PM2.5+CHIR组,于P19细胞未分化时期处理48h,观察AHR抑制剂CH2及WNT激活剂CHIR对凋亡、细胞增殖、细胞周期的调控作用。结果:1.无细胞毒性剂量确定阳性对照组细胞大量死亡,0 mg/L组细胞生长状态良好,与0 mg/L组及阳性对照组相比,100 mg/L组细胞出现明显的细胞毒性,细胞出现大片死亡现象,差异具有统计学意义,1 mg/L及10 mg/L组细胞不产生明显细胞毒性。因此将10mg/L作为无细胞毒性PM2.5暴露剂量,进行后续实验。2.P19小鼠畸胎瘤干细胞心肌定向分化模型成功构建干细胞心肌定向分化模型成功构建,最终形成高表达成熟心肌标志物的心肌细胞,显微镜下可观察到贴壁干细胞呈克隆性生长,悬浮期拟胚体致密规则,贴壁期拟胚体大量细胞从拟胚体边缘爬出并定向分化。用实时荧光定量PCR检测各时期标志物表达情况,全能性时期高表达全能性标志物OCT4,随着分化进行全能性标志物逐渐减少;心肌前体期高表达心肌前体标志物ISL1;成熟心肌期高表达成熟心肌标志物MLC2V,分化末期高表达心肌特异性标志物cTNT蛋白;显示干细胞心肌定向分化过程顺利进行。3.未分化时期暴露10 mg/LPM2.548 h,可阻碍干细胞心肌分化进程、降低心肌细胞分化效率3.1分化各时期细胞形态学异常显微镜下观察对照组和PM2.5暴露组心肌定向分化各时期形态学变化,发现与对照组相比,PM2.5暴露组未分化P19克隆性下降,细胞克隆松散;悬浮期拟胚体紧致性下降,边缘不整齐;贴壁分化期细胞爬出速度缓慢,心肌样分化区域减少。3.2干细胞心肌定向分化过程各时期特异性标志物表达改变实时荧光定量PCR结果显示,暴露PM2.5后,全能性标志物OCT4在未分化时期表达下降,分化启动后反而增高,心肌前体期标志物ISL1于心肌前体期表达降低,成熟心肌标志物MLC2V于成熟细胞期表达降低,结果具有统计学意义。3.3成熟心肌功能性蛋白cTNT表达降低流式细胞术结果显示,未分化时期暴露PM2.5,导致分化末期功能性心肌蛋白cTNT表达降低,心肌分化效率降低,但差异不具有统计学意义。4.未分化时期暴露10 mg/LPM2.5.5 48 h干扰心肌定向分化的可能机制4.1 PM2.5对遗传物质的损伤作用,对凋亡、增殖及细胞周期的影响未分化时期P19干细胞暴露10 mg/LPM2.5.5 48 h,引起明显的DNA双链断裂现象,差异具有统计学意义;有轻度抑制凋亡的作用,差异没有统计学意义;引起细胞增殖抑制,差异具有统计学意义;细胞周期S期比例增多,G2/M期比例减少,分裂期细胞减少,细胞分裂受到抑制,差异具有统计学意义。4.2 AHR信号通路及WNT信号通路的激活情况免疫荧光结果显示,与对照组相比,未分化P19细胞暴露10 mg/LPM2.548 h后,AHR信号通路被显著激活,WNT信号通路受到抑制;加入AHR抑制剂CH2后,AHR信号通路被异常激活的状况明显缓解;加入WNT激活剂CHIR后,WNT信号通路被抑制的状况有所缓解。4.3 AHR抑制剂及WNT及激活剂对凋亡、细胞增殖及细胞周期的调控作用加入AHR抑制剂CH2及WNT激活剂CHIR对凋亡作用不产生显著影响。加入AHR抑制剂,细胞增殖抑制被缓解甚至逆转,细胞周期阻滞现象明显恢复正常,分裂期细胞增多;加入WNT激活剂后细胞增殖受抑制的现象有所缓解但作用不及AHR抑制剂明显,细胞周期被阻滞的现象没有得到有效缓解。结论:1.P19细胞未分化时期PM2.5暴露可干扰心肌定向分化过程,阻碍干细胞心肌定向分化的正常进行。2.PM2.5干扰心肌分化的机制涉及DNA双链断裂、细胞周期和细胞增殖抑制以及AHR信号通路改变。