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目的:
本研究通过上巩膜静脉烧灼法建立小鼠慢性高眼压模型,使用骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)和诱导的多潜能干细胞(Inducedpluripotent stem cells,iPS)进行视网膜下腔移植,观察其在宿主视网膜中的迁移、整合和分化的异同点
方法:
1.取C57BL/6-EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞,用含10%FBS的DMEM/F12培养液进行培养,并添加EGF与bFGF,促进其向神经前体细胞分化。使用原代细胞用于视网膜下腔移植。
2.复苏液氮冻存的转染Math5-iPS细胞,用含10%FBS的DMEM液培养3天,胰酶消化后重悬细胞,制备为密度为108/ml细胞悬液,用于视网膜下腔移植。
3.取65只16-20周C57BL/6小鼠,右眼烧灼鼻上、颞上和颞下象限3条上巩膜静脉,建立慢性高眼压模型,左眼仅打开球结膜,不烧灼静脉,作为伪手术眼。使用Tonopen AVIA测量术前、术后1w、2w、4w的眼压。
4.于术后1w、2w、4w各处死5只小鼠,摘取眼球制作冰冻切片,TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况。
5.术后3w,取小鼠10只,局部麻醉后进行上丘注射荧光金(Fluorogold,FG)逆行标记RGC,1w后处死小鼠,取视网膜,进行铺片计数。
6.在建立高眼压模型后4w时,各取20只小鼠进行视网膜下腔移植,分别注射BMSCs细胞(BMSCs组)和iPS细胞(iPS组)。14w后取材进行免疫荧光检测,观察移植细胞的迁移、整合与分化。
7.上巩膜静脉烧灼术前、烧灼后4w和细胞移植术后4w,每组各取10只小鼠,进行ERG检测,比较小鼠视网膜功能的改变。
结果:
1.用含10%FBS的DMEM/F12生长液培养C57BL/6-EGFP转基因小鼠BMSCs,原代BMSCs呈长梭形,细胞聚集呈克隆样生长。
2.上巩膜静脉烧灼后,小鼠眼压能够升高并维持至少4w的时间。右眼术后各时间点平均眼压与术前及伪手术组的平均眼压有统计学明显差异(P<0.001)。
3.TUNEL检测术后各时间点视网膜细胞的凋亡情况,结果显示,随高眼压的持续,视网膜厚度逐渐变薄,视网膜各层凋亡细胞逐渐增多。
4.移植入视网膜下腔的BMSCs可以迁移、整合至宿主视网膜的节细胞层、内核层和外核层,并与宿主视网膜建立突触联系,但整合效率较低。
5.Math5转染的iPS移植入视网膜下腔后,可以定向的整合进入宿主视网膜的节细胞层,并表达节细胞的特异性标记Thy1.2。
6.上巩膜静脉烧灼后4w,小鼠的ERG检测结果显示,模型组a波和b波的波幅较伪手术组明显降低(P<0.001)。BMSCs和iPS移植术后4w,两组小鼠的ERG的a波和b波波幅较移植前五明显改变(P>0.1)。
7.所有进行BMSCs和iPS移植的小鼠,均未发现肿瘤的形成。
结论:
1、上巩膜静脉烧灼可以建立稳定的小鼠慢性高眼压模型。
2、BMSCs可以整合进入慢性高眼压小鼠受损的视网膜各层结构中,但整合效率低下。
3、iPS可以定向整合进入神经节细胞层,并表达RGC的特异性标记。
4、iPS与BMSCs作为种子细胞进行视网膜下腔移植是较安全的。