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结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)引起的一种以呼吸系统感染为主的慢性传染病,目前全球约有1/3的人感染结核分枝杆菌。目前用于结核病预防的卡介苗(BCG),只能对儿童肺结核起到有效的保护,对成人的保护效果不尽如人意。PE/PPE蛋白家族其编码基因大约占整个结核分枝杆菌基因组的10%,这些蛋白被认为是参与宿主免疫的毒力因子,它们只存在于致病的分枝杆菌中,预示着PE/PPE蛋白在该菌致病中可能发挥重要作用,但大部分PE/PPE蛋白的确切功能亟待阐明。本研究利用耻垢分枝杆菌表达结核分枝杆菌PPE25和PPE27蛋白,以初步探究其生化特性,与巨噬细胞的相互作用及其免疫特性,为结核病新型疫苗的研究奠定基础。1.表达PPe25和PPe27基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,采用PCR技术扩增ppe25和ppe27基因序列并添加FLAG标签,构建重组质粒pMV261-ppe25-flag和pMV261-ppe27-flag,经测序鉴定正确后,将两个重组质粒分别电转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态,PCR鉴定表明重组菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)构建成功。重组菌经45℃ 30min诱导表达后,Western blotting结果表明,表达的融合蛋白PPE25和PPE27与抗FLAG标签单克隆抗体发生特异性的反应,与预期条带大小39.51 kD和37.9 kD一致。2.表达PPe25和PPe27基因重组耻垢分枝杆菌生化特性的研究利用7H9培养耻垢分枝杆菌及重组耻垢分枝杆菌,绘制生长曲线,结果表明重组耻垢分枝杆菌与亲本菌株相比生长速率无明显变化。为了研究PPE25和PPE27蛋白是否与结核分枝杆菌应对多种压力环境能力有关,检测重组菌在SDS表面压力和饥饿条件等体外压力环境下生长情况。实验证明PPE25和PPE27蛋白定位在细胞表面,增加了对饥饿条件和表面压力环境的耐受,但对酸性环境更加敏感。实验还同时检测了重组菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)在巨噬细胞内的生存情况及对巨噬细胞的影响。研究证明PPE25和PPE27蛋白明显增强耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,并且引起巨噬细胞明显的凋亡和细胞坏死(p<0.05)。3.表达ppe25和ppe27基因重组耻垢分枝杆菌的免疫生物学特性研究将重组耻垢分枝杆菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)分别尾部皮下免疫6周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为5×107CFU/只,免疫2周后进行二免,4周后测定重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫反应。ELISA检测免疫小鼠血清抗体水平,结果表明重组菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)免疫组能够诱导产生针对PPE25. PPE27蛋白以及PPE25/27:56-71多肽的特异性抗体。抗体亚类测定表明,M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)以产生IgG1为主。分离小鼠淋巴细胞,利用Brdu法检测淋巴细胞抗原特异性增殖指数(SI),结果显示,以PPE25、PPE27和PPE25/27:44-52多肽刺激均能使免疫小鼠淋巴细胞发生增殖(p<0.05)。研究中还检测了免疫小鼠淋巴细胞分泌Thl型细胞因子TNF、IL-2和IFN-y, Th2型细胞因子IL-4、 IL-6和IL-10。结果PPE27刺激M.S.(pMV261-ppe27-flag)免疫小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IL-6高于对照组(p<0.05),免疫类型偏向Th2型。上述研究结果为PPE25和PPE27蛋白在结核病疫苗研发等奠定了重要基础。