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目的:观察人肝癌细胞表面? 1,3半乳糖基(? 1,3 Gal)表位的表达对肝癌细胞生物学特性的影响以及进一步探讨利用鼠?1,3半乳糖基转移酶(α1,3 galactosyltransferase,α1,3 GT)进行肝癌基因治疗的可行性。方法:1.构建含有鼠α1,3 GT全长cDNA基因的真核表达质粒pcDNA3.1-GT:采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织中扩增α1,3 GT基因的全长cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)内,从而构建含有全长α1,3 GT基因的重组真核表达质粒pcDNA-GT,经双酶切鉴定后,对pcDNA-GT中的目的基因进行测序。2.建立鼠α1,3 GT稳定转染的肝癌细胞株Huh7-GT:①利用脂质体Lipofectamine? 2000将pcDNA-GT转染到人肝癌细胞系Huh7中,经G418抗性筛选得到稳定转染的阳性细胞克隆,命名为Huh7-GT,同时转染空载体pcDNA3.1的稳转细胞株Huh7-pcDNA作对照;②利用RT-PCR法检测α1,3 GT mRNA在Huh7-GT中的表达;③然后利用直接免疫荧光法和流式细胞术观察α1,3-半乳糖基表位在Huh7-GT细胞表面的表达情况;④接着利用补体依赖的细胞杀伤试验观察人正常血清对Huh7-GT的杀伤效应,以进一步证实α1,3-半乳糖基表位在Huh7-GT细胞表面的表达。3.体外试验观察Huh7-GT致瘤性的变化:①利用MTT法检测Huh7-GT细胞的生长速度;②利用平板克隆形成试验检测Huh7-GT细胞克隆形成能力的变化;③流式细胞术进一步检测其细胞凋亡情况的变化。4.观察Huh7-GT在裸鼠体内的成瘤情况:取裸鼠12只,分为3组,平均每组4只,在每组裸鼠皮下分别注射Huh7-GT细胞,Huh7-pcDNA细胞和亲本Huh7细胞,观察这三组裸鼠的成瘤时间、瘤体大小和重量。结果:1.从小鼠心脏组织中扩增出一大小约1100bp的基因片段,经酶切鉴定证实该基因片段成功地克隆到真核质粒pcDNA3.1中,最后DNA测序证实该目的基因片度为全长1080bp的鼠α1,3 GT基因cDNA,遂将构建的重组真核质粒命名为pcDNA3.1GT。2.分别将pcDNA3.1-GT和pcDNA3.1空载体质粒转染Huh7细胞, G418抗性筛选后分别获得稳转细胞株Huh7-GT和Huh7-pcDNA;经RT-PCR法检测发现在Huh7-GT细胞中有α1,3 GT mRNA的表达,而在Huh7-pcDNA和Huh7细胞中没有检测到α1,3 GT mRNA的表达;直接免疫荧光法和流式细胞术观察发现在Huh7-GT细胞表面有α1,3-半乳糖基化表位的表达,Huh7-pcDNA和Huh7细胞表面没有观察到α1,3-半乳糖基化表位的表达;补体依赖的细胞杀伤试验进一步证实人正常血清对Huh7-GT有明显的杀伤效应。3. MTT法证实Huh7-GT细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成试验发现Huh7-GT细胞单克隆形成能力减弱,流式细胞术检测发现Huh7-GT细胞凋亡增多;4.裸鼠成瘤试验发现Huh7-GT细胞组裸鼠的成瘤时间与对照组相比延长,瘤体体积和重量均小于对照组。结论:细胞表面的α1,3半乳糖基化可明显减弱肝癌细胞的致瘤性;本研究为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路。