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本试验利用小麦品种L10与叶锈菌生理小种260和165分别构成不亲和与亲和组合,对自噬体膜来源和功能进行探究。本实验室前期工作利用电镜观察到不亲和组合中寄主发生HR的细胞内有自噬泡存在,采用RNAi和VIGS技术对小麦品种L10中自噬相关基因TaATG8进行沉默,发现在基因沉默植株中HR面积明显大于对照植株,而且吸器母细胞数量也有所增加,证明了不亲和组合中自噬对HR有重要调控作用。为了更加深入了解在该体系自噬形成过程中膜的来源以及自噬对HR的可能调控方式,本论文设计了一系列免疫组化试验,对不亲和互作体系中自噬体膜的来源和自噬体包裹内含物的去路进行研究;同时又对亲和组合中的自噬进行了观察和功能初探,获得的主要结果如下:
1.当利用Anti-ATG8作为一抗对不亲和组合叶片进行免疫金标记时,发现发生HR的细胞中有大量疑似自噬泡的膜上被标记上金颗粒。这一结果确证了不亲和组合中自噬体的存在。
2.利用特异性抗体包括线粒体内膜蛋白抗体和液泡膜蛋白抗体分别作为一抗对不亲和组合叶片进行标记时,发现金颗粒均被标记在自噬体膜上,说明自噬体膜上存在这些蛋白组分。
3.利用特异性抗体包括线粒体内膜蛋白抗体和叶绿体基质蛋白抗体分别作为一抗对不亲和组合叶片进行标记时,发现自噬体可以包裹线粒体和叶绿体基质蛋白进行降解。
4.利用Anti-ATG8作为一抗进行标记时,发现金颗粒被标记在发生HR的细胞与邻近健康细胞之间的胞间连丝上,推测自噬体可能将HR细胞中的内含物包裹起来通过胞间连丝快速运往邻近健康细胞,以此来加速HR细胞的死亡进程。
5.在亲和组合的接种后期,观察到被菌侵染的细胞中存在大量自噬体,暗示着自噬在这种亲和关系的建立中可能发挥重要作用。
6.利用VIGS技术沉默L10中的TaATG8基因后再接种165,结果表明,与未沉默植株相比,在侵染点处菌丝团的生长发育并没有很大差别,且叶片表面的孢子堆的大小也无差别,说明沉默TaATG8后对菌的发育可能没有影响。
1.当利用Anti-ATG8作为一抗对不亲和组合叶片进行免疫金标记时,发现发生HR的细胞中有大量疑似自噬泡的膜上被标记上金颗粒。这一结果确证了不亲和组合中自噬体的存在。
2.利用特异性抗体包括线粒体内膜蛋白抗体和液泡膜蛋白抗体分别作为一抗对不亲和组合叶片进行标记时,发现金颗粒均被标记在自噬体膜上,说明自噬体膜上存在这些蛋白组分。
3.利用特异性抗体包括线粒体内膜蛋白抗体和叶绿体基质蛋白抗体分别作为一抗对不亲和组合叶片进行标记时,发现自噬体可以包裹线粒体和叶绿体基质蛋白进行降解。
4.利用Anti-ATG8作为一抗进行标记时,发现金颗粒被标记在发生HR的细胞与邻近健康细胞之间的胞间连丝上,推测自噬体可能将HR细胞中的内含物包裹起来通过胞间连丝快速运往邻近健康细胞,以此来加速HR细胞的死亡进程。
5.在亲和组合的接种后期,观察到被菌侵染的细胞中存在大量自噬体,暗示着自噬在这种亲和关系的建立中可能发挥重要作用。
6.利用VIGS技术沉默L10中的TaATG8基因后再接种165,结果表明,与未沉默植株相比,在侵染点处菌丝团的生长发育并没有很大差别,且叶片表面的孢子堆的大小也无差别,说明沉默TaATG8后对菌的发育可能没有影响。