头颈鳞状细胞癌是人体常见的恶性肿瘤之一,占人体恶性肿瘤发病率的第六位,其中喉癌又是头颈部鳞状细胞癌中常见的恶性肿,其发病率正在逐年上升。在过去的几十年中,喉癌的治疗较之前有了很大的发展,但患者的5年生存率并没有得到很大的改善。其主要原因就是肿瘤的复发及转移。恶性肿瘤转移受肿瘤微环境和细胞内信号系统调控,上皮细胞间质细胞转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)认为是肿瘤发生转移的源动力和启动环节,β-catenin是与EMT相关的最重要的信号通路蛋白之一。抑制信号转导和转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)激活可以明显抑制喉鳞癌细胞的增殖和迁移。最新研究表明在多种恶性肿瘤中STAT3对β-catenin的表达呈正向调节作用,并对EMT和肿瘤转移产生影响。目前,喉鳞癌中STAT3对β-catenin调节的确切机制还没有最后阐明。本研究针对STAT3对头颈鳞癌EMT的调节及肿瘤转移的影响的机制尚不清楚,从STAT3激活对β-catenin蛋白稳定性和表达水平调控及其对头颈鳞癌EMT影响的角度,展开系统和深入研究,并深入探讨双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)能否作为预防和治疗头颈鳞癌转移靶向药物及其应用策略问题。实验分为三部分:第一部分STAT3和β-catenin在喉癌组织中的表达及与临床病理因素及预后的关系目的:检测p-STAT3与β-catenin在喉癌组织中的表达,并分析其与临床病理因素及预后的关系。方法:收集并整理2009年1月至2013年12月在白求恩国际和平医院耳鼻咽喉-头颈外科初次诊断为喉癌,并进行手术的124例患者的临床及预后资料。对其病理标本进行免疫组织化学染色检测p-STAT3和β-catenin的表达。结果:1.p-STAT3和β-catenin免疫组化染色结果及与临床及病理因素的关系124例喉癌组织中,p-STAT3染色阳性共71例,阴性53例。β-catenin染色阳性57例,阴性共67例。根据p-STAT3和β-catenin免疫组化的结果及统计学结果显示,p-STAT3的表达与肿瘤T分期(P=0.038)、淋巴结转移(P=0.014)、病理分级(P=0.010)明显相关。β-catenin的表达与肿瘤T分期(P=0.007)、淋巴结转移(P=0.004)、TNM分期(P=0.018)以及病理分级(P=0.001)明显相关。对p-STAT3和β-catenin二者间的相关性进行分析卡方检验及spearman等级相关分析,结果显示,二者表达存在显著负相关性(R~2=0.1608,P<0.001)。2.生存情况根据寿命表法描述124例喉癌患者术后的生存情况,患者的中位总生存时间为7年。术后1年的累积生存率为95%,术后3年的累积生存率为86%,术后5年的累积生存率为72%。根据免疫组化评分预测“是否死亡”的敏感性和特异性判定p-STAT3cut-off值为3,β-catenin cut-off值为4用来做统计学分析。将可能影响喉癌预后的影响因素进行Kaplan—Meier法单因素分析,结果提示年龄、性别、T分期、淋巴结转移情况、TNM临床分期病理分级以及p-STAT3和β-catenin的表达情况均影响预后。p-STAT3表达阳性的患者与p-STAT3表达阴性的患者相比,术后生存情况明显较差,且差异具有统计学意义。β-catenin表达阴性的患者比β-catenin表达阳性的患者生存期缩短。而p-STAT3表达阳性,β-catenin表达阴性的患者,预后最差,中位生存时间为50个月,95%CI为(39.6,60.4)。Cox多元回归模型生存分析筛选出影响喉癌预后的独立影响因素为淋巴结转移情况(HR=2.26,95%CI=1.10,4.66,P=0.027)及β-catenin的表达情况(HR=0.36,95%CI=0.13,0.98,P=0.045)。小结:在喉癌组织中p-STAT3和β-catenin的表达具有明显负相关性,且与喉癌的临床病理因素及预后密切相关,其中淋巴结转移情况及β-catenin的表达情况可以作为喉癌预后的独立因素。第二部分慢病毒介导过表达p-STAT3基因人喉癌Tu212细胞的构建及对喉癌细胞侵袭及转移的作用目的:构建慢病毒介导的过表达p-STAT3基因人喉癌细胞系,为后续研究p-STAT3在喉癌EMT、侵袭及转移过程中的作用提供细胞模型,并研究过表达p-STAT3对喉癌细胞侵袭及转移的影响。方法:1.将质粒载体与目的基因连接,获得产物质粒DNA,并与JM109感受态细胞转化,筛选阳性克隆菌落,进行鉴定。2.将构建成功的目的质粒导入293T细胞,产生高滴度含目的基因的慢病毒,用慢病毒来感染Tu212细胞,筛选稳转细胞系。3.Western blot检测转染后Tu212细胞中p-STAT3的蛋白的表达水平。4.显微镜下观察,p-STAT3处于过表达状态下喉癌细胞的形态。5.Transwell检测p-STAT3过表达状态下细胞侵袭转移数量的变化。6.免疫荧光化学方法检测细胞中p-STAT3和β-catenin在细胞内的表达情况。结果:1.成功构建了稳定稳定过表达p-STAT3基因的喉癌Tu212-Luciferase-hSTAT3细胞系。Western blot实验检测Tu212-Luciferase-hSTAT3组比对照空白对照组及对照组p-STAT3蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(t=-10.289,P=0.009;t=-11.928,P=0.007)。2.慢病毒介导改变STAT3的活化状态对喉癌侵袭及转移能力的影响(1)慢病毒介导过表达p-STAT3后细胞形态的变化经过表达慢病毒包装好后,喉癌细胞的形态变得更加细长,细胞间的距离增加,但细胞数量增多。(2)慢病毒介导过表达p-STAT3对喉癌细胞侵袭及迁移的影响在小室上室分别培养对照组和实验组细胞,12 h后,实验组转移到下室的数目为357±27个,而对照组为107±15个,二者差异亦具有统计学意义(t=11.399,P=0.001);24 h后,实验组细胞侵袭穿过小室的数目为363±46个,而对照侵袭的数目为103±7个,实验组明显高于对照组,差异具有统计学意义(t=7.921,P=0.014)。(3)慢病毒介导过表达p-STAT3对β-catenin表达的易位情况改变过表达慢病毒包装的Tu212细胞,细胞核中p-STAT3的表达明显增多,而β-catenin在细胞膜上的表达比对照组减少,胞质及核内的表达升高。小结:1.利用慢病毒载体成功构建稳定过表达p-STAT3基因的喉癌Tu212细胞,为后续研究提供细胞模型。2.利用慢病毒载体过表达p-STAT3,可以影响喉癌细胞的形态,并增强细胞的侵袭及转移能力。第三部分双氢青蒿素对喉癌细胞EMT、侵袭及转移的作用及其可能机制目的:通过DHA改变STAT3的活化状态,观察β-catenin的表达情况及在喉癌细胞内的位置变化,EMT相关蛋白的表达情况,喉癌细胞迁移侵袭情况的改变,进一步探讨DHA通过STAT3对EMT及肿瘤侵袭转移过程中发挥的作用,以及STAT3对β-catenin的调控作用并探讨其作用机制。方法:1.用MTT法检测不同浓度DHA干预两种喉癌细胞(Tu212、Hep-2)24 h及48 h后细胞活力状况,计算对应的IC50值。根据计算出的IC50值设定合理的药物干预计量。2.Western blot观察随着不同浓度DHA抑制喉癌细胞中p-STAT3的表达变化及EMT及侵袭相关蛋白β-catenin、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、GSK-3β、p-β-catenin、MMP-9的表达情况及p-STAT3处于不同状态下EMT及侵袭相关蛋白的表达情况。3.显微镜下观察,DHA抑制p-STAT3表达后喉癌细胞的形态。4.Transwell检测p-STAT3不同状态下细胞侵袭转移数量的变化。5.免疫荧光化学方法检测用不同DHA浓度处理的Hep-2、Tu212细胞中p-STAT3和β-catenin在细胞内的表达情况。结果:DHA对喉癌细胞侵袭及转移能力的影响1.DHA抑制喉癌细胞Hep2、Tu212的增殖DHA能够抑制Hep2、Tu212细胞的增殖,且与药物剂量及时间有依赖关系。DHA干预Hep-2细胞24和48 h的IC50值分别为51.31和29.22μM,干预Tu212细胞的IC50值分别为30.03和11.89μM。2.DHA对喉癌细胞形态的改变一定浓度的IL-6和DHA分别处理喉癌细胞Hep-2和Tu212细胞后,采用倒置显微镜观察,DHA组的细胞数量减少,培养基中悬浮大量死细胞,细胞体积变小,形态多成圆形;而IL-6使细胞形态更多样化。3.不同浓度DHA影响喉癌细胞EMT及侵袭相关蛋白的表达不同浓度的DHA,分别处理Hep-2细胞(0、10μM、20μM、40μM、80μM),Tu212细胞(0、5μM、10μM、20μM、40μM),Western blot检测相关蛋白的表达。两种肿瘤细胞的p-STAT3、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、GSK-3β、MMP-9、p-β-catenin、E-cadherin蛋白表达水平随DHA浓度的变化而变化的趋势相同。p-STAT3、β-catenin、N-cadherin、Vimentin和MMP-9的表达水平随着DHA浓度的升高而降低,而GSK-3β、p-β-catenin和E-cadherin的表达随着DHA浓度的升高而升高。4.DHA对IL-6刺激p-STAT3表达后喉癌细胞β-catenin及EMT相关蛋白的表达将细胞分为4个处理组:对照组,DHA组,IL-6组,DHA+IL-6组,Western blot对目的蛋白进行检测并进行组间两两比较,组间差异及两两之间的差异均具有统计学意义。Hep-2细胞经DHA处理后,p-STAT3蛋白的表达量降低,当经IL-6处理时,p-STAT3蛋白的表达水平增高。当同时经DHA及IL-6处理后,p-STAT3蛋白的表达水平相比单独IL-6处理组降低,单独DHA处理组有所增加,且差异均具有统计学意义。其中,β-catenin、N-cadherin、Vimentin和MMP-9水平的变化趋势与p-STAT3变化趋势大致相同,而E-cadherin、GSK-3β和p-β-catenin蛋白水平的变化趋势与p-STAT3正好相反。在Tu212细胞中,各蛋白的表达趋势与Hep-2细胞中一致。5.DHA对喉癌细胞侵袭及迁移的影响在Hep-2细胞中,对照组,DHA组,IL-6组,DHA+IL-6组。12 h迁移到下室的细胞数目分别为544±47个,224±35个,640±13个,272±35个,组间差异具有统计学意义(F=69.250,P<0.05)两两比较结果显示,除DHA组和IL-6+DHA组差异没有显著意义(P=0.202),其余两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。24 h后,对应4个处理组中细胞侵袭穿过小室的数目分别为293±33个,80±13个,373±42个,123±20个,组间差异具有统计学意义(F=45.261,P<0.05),两两比较结果显示,除DHA组和IL-6+DHA组差异没有显著意义(P=0.182),其余两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。在Tu212细胞中,对应4个处理组,12h转移到下室的细胞数目分别为453±59个,256±35个,736±47个,427±49个,组间两两比较差异具有统计学意义(F=33.925,P<0.05)。DHA组与对照组(P=0.004),DHA组和IL-6+DHA组(P<0.05)组间差异均具有统计学意义;24h后,对应4个处理组中细胞侵袭穿过小室的数目分别为299±20个,203±20个,336±13个,272±13个,组间两两比较差异具有统计学意义(F=22.267,P<0.05)。DHA组与对照组(P<0.05),DHA组和IL-6+DHA组(P=0.005)组间差异均具有统计学意义。6.DHA对p-STAT3和β-catenin表达的易位情况的影响用DHA处理的实验组中,p-STAT3在细胞核中的表达明显减少,β-catenin在细胞膜上的表达增多,细胞核内表达减少,但β-catenin的荧光表达总量是增多的。小结:1.DHA可以改变喉癌细胞的形态;而IL-6使细胞形态多样化。2.DHA可以通过抑制p-STAT3的表达影响EMT及侵袭相关蛋白的表达,并抑制细胞的侵袭及转移作用,有望成为抑制喉癌转移和复发的新药物。3.p-STAT3可能通过抑制GSK-3β的表达,来调控β-catenin的表达。4.STAT3可能通过β-catenin调控喉癌细胞的EMT及侵袭转移过程。结论:1.在喉癌组织中p-STAT3和β-catenin的表达具有明显负相关性,且与喉癌的临床病理因素及预后密切相关,其中淋巴结转移情况及β-catenin的表达情况可以作为喉癌预后的独立因素。2.利用慢病毒载体成功构建稳定过表达p-STAT3基因的喉癌Tu212细胞,为后续研究提供细胞模型。3.利用慢病毒载体过表达p-STAT3,可以影响喉癌细胞的形态,并增强细胞的侵袭及转移能力。4.DHA可以改变喉癌细胞的形态;而IL-6使细胞形态多样化。5.DHA可以通过抑制p-STAT3的表达影响EMT及侵袭相关蛋白的表达,并抑制细胞的侵袭及转移作用,有望成为抑制喉癌转移和复发的新药物。6.p-STAT3可能通过抑制GSK-3β的表达,来调控β-catenin的表达。7.STAT3可能通过β-catenin调控喉癌细胞的EMT及侵袭转移过程。