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肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAFs)在TNF受体超家族和白细胞介素-1受体/Toll样受体(IL-1R/TLR)超家族的信号传导过程中发挥着至关重要的作用。TRAFs单独或协同在多种生物过程和机体免疫中发挥重要作用。然而,硬骨鱼中TRAF基因家族的系统鉴定尚未见报道,关于它们在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)先天免疫中的作用很少被研究。本研究中,通过生物信息学鉴定分析了半滑舌鳎中TRAF基因家族七个成员Cs TRAF2a、Cs TRAF2b、Cs TRAF3、Cs TRAF4a、Cs TRAF5、Cs TRAF6和Cs TRAF7,并克隆了Cs TRAF2a、Cs TRAF2b、Cs TRAF3、Cs TRAF4a、Cs TRAF5和Cs TRAF7完整的ORF序列,七个TRAF基因(Cs TRAF2a-Cs TRAF7)的ORF区全长依次分别为1791、1629、1779、1413、1668、1731、1965 bp。序列分析显示Cs TRAFs具有多样性的基因结构,并且与哺乳动物TRAFs相比包含典型的保守结构域。系统发育分析表明了硬骨鱼中TRAF家族成员的进化关系,大部分硬骨鱼类缺失TRAF1、部分硬骨鱼类缺失TRAF5。基因结构和motif分析表明,半滑舌鳎和其他几种硬骨鱼类的外显子-内含子结构和保守motif的多样性及分布。实时定量PCR检测了健康组织中Cs TRAFs基因的表达分布和哈维氏弧菌感染后Cs TRAFs在主要免疫组织鳃、肝脏和脾脏中的表达模式。结果表明仅Cs TRAF2a在脑中相对高表达,其余Cs TRAFs在免疫相关组织中高度表达并参与致病菌感染后的免疫应答。哈维氏弧菌感染后,大多数Cs TRAFs基因(Cs TRAF2b,Cs TRAF3,Cs TRAF4a,Cs TRAF5,Cs TRAF6)的相对表达水平显著上调,仅Cs TRAF7先表现出显著性下调随后上调,但在感染后检测的三种重要免疫相关组织(鳃,肝脏,脾脏)中没有显著性高于初始水平。对Cs TRAF3、Cs TRAF4a和Cs TRAF6的功能验证发现,在HEK293T细胞中过表达Cs TRAF3、Cs TRAF4a均不能显著性诱导提高NF-κB活性,只有Cs TRAF6可以激活NF-κB。另外,初步验证了靶向调控TRAF家族成员Cs TRAF6的mi RNA mi R-33-p5。这些结果为半滑舌鳎TRAFs在免疫反应中的不同作用提供了有价值的信息。蛋白激酶C(PKC)广泛参与哺乳动物T、B淋巴细胞涉及的免疫反应并发挥重要作用,然而PKC在鱼类免疫过程中的作用却少有报道。本研究中,克隆了半滑舌鳎PKC家族的典型成员PKCα(命名为Cs PKCα),并进行了分子特征和表达模式分析。Cs PKCα的c DNA全长为2315 bp,其中ORF区2013 bp。q RT-PCR分析显示Cs PKCα在各个组织中广泛表达,其中在免疫相关组织鳃、肝脏、皮肤和肠中具有较高的转录水平,暗示Cs PKCα可能在免疫过程中发挥作用。随后检测了Cs PKCα在哈维氏弧菌感染后6种免疫相关组织(鳃、肝脏、皮肤、肠、脾脏和肾)中不同时间点的表达水平,发现细菌侵染后Cs PKCα在鳃、肾脏、皮肤和脾脏中检测到显著上调,在肝脏中出现显著性下调。这些结果表明Cs PKCα可能在应对哈维氏弧菌的免疫应答中发挥作用,但是否参与病原菌侵染的巨噬细胞激活以及与T、B细胞相关的信号通路还需要进一步研究。