微丝是支撑细胞的蛋白纤维网架系统,在细胞迁移、胞内物质运输等细胞活动中起必不可少的作用。病毒作为严格的胞内寄生者,为了创造有利于自身入侵、复制和释放的环境,进化了多种与宿主细胞骨架相互作用的机制,从而达到顺利入侵、准确到达复制位点进行高效复制、以及快速、远距离传播的目的。而细胞微丝被干扰后,细胞内病毒的活动也会受到明显抑制。广义上的微丝骨架也包括紧密连接蛋白部分。猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给养猪业带来巨大经济损失。本文以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为试验对象,首次研究猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）与宿主细胞微丝骨架之间的相互作用,以及其对紧密连接的影响。填补猪流行性腹泻感染机理方面的研究空白,为日后进行猪流行性腹泻病毒的深入研究提供一定基础。1猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞的病理变化本试验以vero细胞扩繁、TCID₅₀为105.5/mL的PEDV试验材料,摸索合适的感染复数感染IPEC-J2田胞。以蔗糖密度梯度离心方法浓缩纯化病毒,电镜负染观察病毒形态。见大量散在的、形态完整的病毒粒子,病毒粒子形态呈圆形、椭圆形、肾形和多边形。以HE染色观察感染PEDV的IPEC-J2细胞,发现细胞肿胀变圆、折光性加强,细胞内出现很多小空泡；伴随空泡增多、逐渐合并形成大空泡,肿胀的细胞脱落、形成空隙；最终大量脱落的细胞碎片漂浮于细胞瓶中。RT-PCR方法检测PEDV的增殖情况,在感染6h后PEDV开始大量迅速增殖,12h达到最高峰,随后病毒量逐步下降。电镜观察IPEC-J2细胞感染PEDV的超微结构变化,通过扫描电镜观察可见细胞微绒毛大量脱落消失、微绒毛顶端膨大变圆、可见数根融合形成蘑菇样膨大。透射电镜结果显示微绒毛内部微丝束消失、细胞内部微丝束紊乱、线粒体空泡化严重,细胞核膜与病毒接触部分出现溶解,未接触部分核膜界限清晰。结果说明,病毒可以在IPEC-J2细胞上复制增殖,出现典型的空泡状病变,同时引起微绒毛脱落与细胞内部微丝骨架的紊乱。提示PEDV能够引起细胞内部微丝骨架的改变。2猪流行性腹泻病毒对紧密连接的影响本试验主要从细胞跨膜电阻的测定、肠上皮细胞旁路转运试验来研究PEDV对肠上皮细胞屏障的影响,间接反映紧密连接完整性；随后通过检测细胞紧密连接蛋白表达量来直接反映紧密连接的改变情况。PEDV感染IPEC-J2细胞的跨膜电阻值在感染后有短暂的上升,60min下降,直到12h电阻值再度高于正常对照组值。肠上皮细胞的细胞旁通道转运试验显示,随着感染时间的延长,荧光渗透性标记分子在细胞旁路转运量不断加大,转运率也逐渐增高。以Western blot检测PEDV对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达量的影响,发现紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）和粘附连接蛋白（E-cadherin）的表达发生了不同程度的变化。Claudin-1和ZO-1这两种蛋白的表达量下调显著。到了60min,除了E-cadherin的表达量基本正常外,其余三种蛋白的表达量均下降到了正常表达量的85%左右。结果提示,PEDV的感染对紧密连接蛋白的表达量影响较小,而结合PEDV对微丝的影响极为显著,我们推测,PEDV可能并不依赖紧密连接蛋白作为入侵受体,而是病毒引起微丝骨架的重组,诱发近微丝环的收缩,从而导致紧密连接蛋白的变动。3猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用本试验主要探讨猪流行性腹泻病毒在感染过程中与微丝骨架之间的关系。以FTTC-phalloidin染色法对感染后的IPEC-J2细胞进行观察后发现,微丝骨架感染后发生有规律的变化,我们人为地将微丝的变化划分为五个不同时期：解聚一期（0-40min）,环膜期（60min）,解聚二期（80min-100min）,环核期（6h-48h）,凋亡期（72h）。解聚一期,微丝开始解聚,微丝在细胞内呈现绿色雾状；环膜期,部分微丝束开始恢复,在细胞膜下形成围绕细胞的环状高亮微丝束；解聚二期,微丝再次开始发生解聚,肌动蛋白弥散分布；环核期,微丝在细胞核附近堆积形成散乱的斑块,部分细胞在细胞膜下有一圈微丝形成的亮环,细胞间界限模糊；凋亡期,细胞大部分凋亡,脱落,残存的细胞微丝聚集浓染,为典型的凋亡细胞染色特征。以微丝稳定剂（Jas）和细胞松弛素D（Cyto D）改变细胞微丝的状态,通过检测细胞内病毒的TCID₅₀来反映病毒的侵染情况。Jas和Cyto D都能够干扰PEDV入侵、复制和释放,Cyto D影响PEDV复制和释放的效果更为显著（P<0.01）。结果提示,在PEDV感染宿主细胞的过程中,病毒能够影响微丝的分布,改变F-actin的数量,同时微丝对病毒有反作用,影响病毒的入侵、复制与释放。