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锌和铁是植物生长发育所必需的微量营养元素,在植物体内的许多生化反应中充当重要的角色。因此,为吸收足够的锌铁,又避免过量吸收造成的毒害,植物进化形成完整的吸收、利用和储存系统以保持体内锌铁的平衡。锌铁调控转运体ZIP(Zinc-regulated transporters,Iron-regulated transporter-like proteins)对于锌铁的吸收、转运及体内平衡的调节有重要作用。因此,本论文对玉米(Zea mays L.)ZIPs基因家族成员的表达谱、亚细胞定位及功能进行了深入分析。利用农杆菌介导的方法得到了转基因拟南芥及玉米,为研究ZmZIPs对转基因拟南芥及玉米中锌铁的吸收、转运及体内平衡的影响,对转基因拟南芥及玉米进行了基因表达及表型的分析。主要研究结果如下: 1、为对ZmZIPs基因功能的研究做铺垫,对ZmZIPs在玉米中的表达模式及其亚细胞定位进行了分析。Real-time RT-PCR检测显示ZmIRT1(Iron-regulated transporter-like proteins in Zea mays,ZmIRT)主要在玉米的花丝与胚中表达,并且原位杂交实验证明ZmIRT1主要在根与茎的分生组织表达;ZmZIP3(Zinc-regulated transporters,Iron-regulated transporter-like proteins Zea mays,ZmZIP)主要在玉米叶片中表达;ZmZIP4主要在雄穗中表达;而ZmZIP7在根、茎、叶及种子中的表达量较雄穗及幼嫩的雌穗高。ZmIRT1、ZmZIP3、ZmZIP4与ZmZIP7均定位于质膜与内质网。根据ZmZIPs基因的表达部位不同,推测其在玉米吸收及转运锌铁过程中可能具有不同的作用。 2、为初步研究ZmZIPs的功能,利用过表达拟南芥对ZmIRT1、ZmZIP3与ZmZIP7三个基因的锌铁转运活性进行了研究,并对参与锌铁吸收、转运及储存基因的表达进行了分析。通过电感耦合等离子体原子发射光谱ICP-OES(Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)法对转基因拟南芥各个组织进行了锌铁含量的测定,并对根及茎叶用Zinpyr-1染料进行了锌的染色。结果显示,锌铁的含量在ZmIRT1过表达拟南芥的根与种子中明显升高,而在茎叶中的积累降低;在ZmZIP3过表达拟南芥根中锌的含量升高,而茎叶中锌的含量降低;在ZmZIP7过表达植株根与茎叶中锌铁的含量均升高,而只有铁的含量在籽粒升高。此外,转基因植株与野生型植株相比能耐受各种锌铁条件。表明ZmIRT1、ZmZIP3与ZmZIP7具有在植物中吸收转运锌铁的功能,并且具有不同的离子选择性。此外,参与锌铁吸收及转运相关基因的表达结果显示,ZmIRT1激活了金属吸收相关基因的表达,而抑制了参与细胞内外转运基因的表达;ZmZIP3抑制了除NAS1以外的其它参与锌铁吸收、转运以及细胞内外转运基因的表达;ZmZIP7激活了缺铁诱导以及负责锌铁吸收、储存基因的表达。说明异位过表达ZmIRT1与ZmZIP7可能激活了拟南芥内源铁的吸收机制,促进了金属的吸收及体内平衡。 3、为研究ZmIRT1与ZmZIP4在玉米中的作用,利用农杆菌介导的方法得到了过表达转基因玉米,对ZmIRT1与ZmZIP4在玉米中的表达量以及转基因玉米中锌铁的含量进行了测定。表达结果显示,ZmZIP4在转基因植株根与茎叶的表达量均升高,在根中比野生型植株升高400倍,并且ZmZIP4在转基因植株胚与胚乳中的表达量均比野生型升高。锌铁含量测定结果显示,过表达ZmZIP转基因植株根中铁的含量比野生型增加一倍,并且铁在籽粒中的含量增加23.3%;锌在转基因籽粒中的含量比野生型增加19.9%。由此推测ZmZIP4可能将更多的锌铁吸收至根进而转运至籽粒中。农艺性状调查结果显示,过表达ZmZIP4玉米籽粒的百粒重比野生型增加13.9%,其它性状均无明显变化。推测可能是由于ZmZIP4的过表达增加了植株中的锌铁含量促进了玉米的代谢进而影响了籽粒的重量。此外,ZmIRT1在过表达玉米胚与胚乳中的表达量均比野生型升高,相应的ZmIRT1过表达玉米籽粒的锌铁含量也升高,说明过表达ZmIRT1能够增加玉米籽粒的锌铁含量。 以上结果表明,ZmIRT1、ZmZIP3、ZmZIP4与ZmZIP7在植物体内具有锌铁转运活性,并且具有不同的离子选择性;ZmZIPs在吸收、转运及保持体内锌铁平衡中可能具有不同的作用;结合表达结果推测ZmIRT1与ZmZIP7具有将锌铁吸收至根及在籽粒积累锌铁的功能;ZmZIP3可能在玉米叶片负责锌的转运;ZmZIP4主要在雄穗负责锌铁的运输。此外,过表达ZmIRT1与ZmZIP4能够提高玉米籽粒的锌铁含量,为玉米锌铁高效转基因育种提供具有自主知识产权的功能基因和基础材料。