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金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白（Serine-rich repeat protein,SRRP）又称富丝氨酸血小板结合蛋白（serine-rich adhesion for platelets,SraP）是金黄色葡萄球菌细胞壁锚定蛋白,其配体结合区的L-Lectin模序能够识别并结合细胞膜表面的唾液酸化受体,该受体在哺乳动物的血小板、肺及胃肠道等细胞表面均有表达。研究表明,SraP能够介导金黄色葡萄球菌与血小板的结合,促进感染性心内膜炎的发生发展。本课题通过基因工程技术表达重组SraPL-Lectin抗原,继而免疫小鼠,利用细胞融合技术制备抗SraPL-Lectin单克隆抗体,通过Western blot、ELISA等技术检测抗体活性,并通过细胞和动物实验,探讨该抗体在抗金黄色葡萄球菌感染过程中的功能。目的:利用基因工程技术制备SraPL-Lectin重组蛋白,细胞融合技术制备抗SraPL-Lectin单克隆抗体,通过体内外实验明确抗SraPL-Lectin抗体在抗金黄色葡萄球菌感染中的功能,为治疗金黄色葡萄球菌感染靶点的开发奠定实验基础。方法:1.重组蛋白SraPL-Lectin的表达:采用PCR技术扩增srapL-Lectin基因片段并引入酶切位点,将特异srapL-Lectin基因片段连接到pET28a载体,并转入感受态大肠埃希菌DH5α,提取质粒经测序比对正确后,转入感受态大肠埃希菌BL21,经0.1M IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,超滤管浓缩,PBS置换洗脱液后保存。2.抗SraPL-Lectin单克隆抗体的制备:用SraPL-Lectin抗原免疫小鼠,采用细胞融合细胞技术制备小鼠脾-SP2/0杂交瘤细胞。经ELISA筛选获取稳定表达抗SraPL-Lectin抗体的杂交瘤细胞株,扩大培养后注入小鼠腹腔,收集腹水,Protein G柱纯化抗体,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,用超滤管浓缩,PBS置换洗脱液后保存。3.SraPL-Lectin单克隆抗体的功能检测:采用Western blot、ELISA检测抗SraPL-Lectin单克隆抗体的生物活性。利用A549细胞的粘附与侵入实验,鼠巨噬细胞炎症因子诱导实验,CCK8增殖抑制实验,吞噬实验及抗体被动免疫实验检测该抗体在抗金黄色葡萄球菌感染中的功能。结果:1.成功构建重组质粒pET28a-srapL-Lectin并表达重组蛋白SraPL-Lectin,SDS-PAGE和Western blot结果表明原核表达重组蛋白SraPL-Lectin分子量约为30KDa。2.成功免疫小鼠并获得SraPL-Lectin单克隆抗体,SDS-PAGE和Western blot结果表明抗SraPL-Lectin单克隆抗体于55KDa、25KDa处存在重链、轻链条带。3.Western blot和ELISA结果表明抗SraPL-Lectin抗体能特异识别重组蛋白SraPL-Lectin,且具有浓度依赖性。细胞实验和动物实验表明,抗SraPL-Lectin抗体能有效阻断金黄色葡萄球菌对A549细胞的粘附与侵入,显著降低金黄色葡萄球菌诱导鼠巨噬细胞产生的炎症反应,减少受感染的鼠巨噬细胞培养上清和小鼠血液中的金黄色葡萄球菌数量。结论:本研究成功制备了抗SraPL-Lectin抗体,并验证该抗体能特异结合SraPL-Lectin抗原,且具有浓度依赖性。细胞实验和动物实验表明,预孵育（注射）该抗体能抑制金黄色葡萄球菌对宿主的侵袭与感染,有效降低细菌载量。本研究采用基因工程技术,通过免疫和细胞融合技术获得的抗SraPL-Lectin抗体可能具有抗金黄色葡萄球菌感染的潜在价值,为开发新型抗金黄色葡萄球菌感染的药物奠定了基础。