药物成瘾包括身体依赖和精神依赖两个方面。精神依赖的形成是一种特殊的恶性学习记忆过程，学习记忆在药物成瘾中居于重要的中心环节,这是当前国际成瘾医学领域的一个全新认识。能否通过阻断反复用药造成的长期记忆来减轻或消除患者的精神依赖，防止复吸是药物成瘾防治中一个崭新的研究领域。本课题的研究方向是:在基因水平探索阻断与药物成瘾有关的学习记忆过程，为有效地防止复吸提供实验依据。筛选及鉴定与药物成瘾记忆相关的目的基因是研究的第一步，也是本课题的主要内容。由于基因表达的改变是药物成瘾时中枢神经元发生相对稳定的功能改变导致长时程行为可塑性变化的主要分子机制，也是药物成瘾相关记忆形成的基础，因此釆用基因差异表达分析技术,检测正常及吗啡依赖大鼠与成瘾记忆密切相关的组织之间基因表达的差异是寻找有意义目的基因的有效途径患者复吸的诱发因素有三类：(1)与以前用药相关的环境刺激。(2)看到或注射成瘾药物本身。(3)应激事件。其中与以前用药相关的环境刺激是导致患者复吸的首要因素。在研究复吸的动物实验中，通过条件反射，环境刺激可与成瘾药物注射之间建立联系，并获得唤起动物复吸行为的能力，出现条件性位置偏爱。条件性位置偏爱是研究药物成瘾精神依赖的重要动物模型，其实质是大脑的一种行为学习的过程，条件性位置偏爱出现表明动物形成了与成瘾环境相关的记忆。本课题首先建立吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠动物模型；采用抑制消减杂交技术构建正常与吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠海马组织mRNA的抑制消减cDNA文库；应用反向Northern 杂交筛选差异表达基因；使用原位杂交技术观察相关基因的细胞定位及表达后，采用反义核酸技术封闭靶细胞目的基因的表达,观察吗啡依赖大鼠条件性位置偏爱行为的变化,同时对差异表达基因的功能进行鉴定，为基因治疗药物成瘾提供实验资料。一、吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠动物模型的建立本部分实验把大鼠吗啡身体依赖的制备与条件性位置偏爱训练有机地结合起来，成功建立了吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠动物模型，并对条件性位置偏爱行为的形成、保持和消退进行了全面的观察。结果发现：(1)连续5天，每天2次，每次从10mg/kg至50mg/kg以逐日递增剂量的方式皮下注射吗啡，停药后24h和48h大鼠体重明显下<WP=9>降，同时出现了腹泻、激惹等戒断症状，表明大鼠形成了吗啡身体依赖。(2)训练后48h,吗啡注射大鼠在白箱的平均停留时间比对照组明显增加，表明经过5天的训练大鼠能够形成稳定的条件性位置偏爱。(3) 吗啡依赖大鼠条件性位置偏爱行为的形成、保持和消退有一定的规律。本实验中大鼠的条件性位置偏爱行为在训练结束后48h形成， 12d时达到高峰， 24d出现消退， 27d条件性位置偏爱行为消失。二、大鼠海马与吗啡依赖记忆相关差异表达基因cDNA文库的构建和筛选本部分实验将SSH技术和SMARTTMPCR cDNA合成法结合起来，成功建立了吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠海马差异表达基因的cDNA文库，通过反向Northern杂交初步筛选分离克隆到12个上调表达9个下调表达cDNA片段，并进行了测序和同源性分析。其中有3个上调表达和1 个下调表达cDNA片段与GeneBank已知序列同源性不足10%，可能是新基因。另外有3个上调表达和2个下调表达cDNA片段与已知序列同源性在20%-60%之间，可能是已知基因，但多数尚无相关的功能报道。其余的6个上调表达和6个下调表达cDNA片段的同源性70%以上，应是已知基因；其中NELL2、Fau、Ferritin-H和Kidins 220四种上调表达基因和甘油-3磷酸脱氢酶下调表达基因已知功能与神经元突触的可塑性改变相关，C2H2锌指蛋白下调表达基因产物是一种转录抑制因子，与DNA结合后调控相关的基因表达，这些基因可能在大鼠与吗啡依赖记忆的形成中发挥重要作用。三、大鼠与吗啡依赖记忆相关差异表达基因mRNA在海马及毗邻脑区的表达本部分实验利用构建好的吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠海马差异表达基因cDNA文库，通过巢式PCR的方法合成地高辛标记的cDNA探针，运用原位杂交技术研究NELL2、Fau、Ferritin-H和C2H2锌指蛋白基因mRNA在大鼠海马及毗邻脑区的表达，并观察上述四种基因在正常和吗啡依赖形成条件性位置偏爱大鼠海马的表达是否存在差异，进一步验证差异表达基因的真实性。结果发现：(1)NELL2、Fau、Ferritin-H和C2H2锌指蛋白四种基因mRNA 阳性反应细胞除大鼠海马外，还分布于杏仁核群、扣带后皮质、梨状皮质、纹状皮质以及部分丘脑核团。(2)NELL2、Fau、Ferritin-H三种上调表达基因在吗啡依赖形成条件性位置偏爱实验组大鼠海马的表达明显高于生理盐水对照组，脑区分布也更广泛；而 C2H2锌指蛋白下调表达基因则相反，表明本实验筛选出的差异表达基因真实可信，另外也说明本实验构建的抑制消减杂交文库是成功的。(3)NELL2、Fau、Ferritin-H、C2H2锌指蛋白基因mRNA阳性反应细胞主要位于海马Ammon’角的锥体细胞层和齿状回的颗粒细胞层，这两个部位是海马神经元高度可塑性的区域。提示这四种基因在海马的主要功能可能是参与药物成瘾相关的学习记忆过程，与大鼠吗啡依赖环境刺激和药物奖赏效应之间条件?