团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国特有的经济淡水鱼类之一,但是随着团头鲂养殖密度的增加以及养殖环境的恶化,导致其抗病能力降低,病害频发,尤其是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症严重影响了团头鲂养殖业的发展,造成了巨大的经济损失,为了解决鱼类养殖中病害多发的问题,越来越多的研究学者开始研究鱼类的免疫应答反应及其调控机制。因此,本研究通过对团头鲂Toll样受体(toll like receptors,tlrs)及干扰素调节因子(interferon regulatory factors,irfs)基因表达及其功能等方面进行分析,有利于掌握其在调节团头鲂抗细菌免疫应答中的作用,为鱼类细菌性疾病的预防和治疗提供基础参考资料。本研究主要结果如下:1.鉴定出4个能够特异性识别细菌组分的tlrs基因,分别为团头鲂tlr5a(Matlr5a)、Matlr5b、Matlr9和Matlr21。序列分析表明,4个MaTlrs都具有典型的TLR蛋白结构特征,包括胞外LRR(Leucine-rich repeat)结构区域,胞内TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构区域及跨膜TM(Transmembrane)结构区域,并预测了胞外LRRCT结构域和胞内TIR结构域的蛋白质3D结构,分析发现二者均呈现较为保守的结构特征,并且LRRCT结构域符合α螺旋和β折叠串联结构的特征。系统进化分析显示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21分别属于TLR5亚家族,TLR7亚家族和TLR11亚家族。利用荧光定量PCR方法检测Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在组织中的表达量,结果显示,其在所有检测的组织中均有表达,并且在免疫器官和淋巴样组织中的表达量相对较高。此外研究还发现,嗜水气单胞菌可以有效的诱导Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在感染后团头鲂的肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃中上调表达。2.克隆得到11个团头鲂irfs(Mairfs)基因,利用Clustal W和SMART在线分析蛋白质序列特征,结果显示,这11个蛋白质都属于非跨膜蛋白并且无信号肽序列,除了MaIrf1和MaIrf2,其余MaIrfs都含有两个保守功能域:IRF和IRF3功能域。预测11个MaIrfs蛋白质的氨基端和羧基端3D结构,结果显示,同一家族的Irfs因子蛋白质的氨基端结构几乎一样,显示出极高的保守性。系统进化分析显示11个MaIrfs分别属于IRF1亚家族,IRF3亚家族,IRF4亚家族和IRF5亚家族。利用荧光定量PCR方法检测了11个Mairfs基因在组织中的表达情况,发现其在所有检测的组织均有表达,而且在免疫器官和淋巴样组织中的表达量相对较高。研究还发现,嗜水气单胞菌感染团头鲂后,可以有效的调控这些基因在肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃中的表达变化,参与机体抗嗜水气单胞菌的免疫应答。通过原核表达系统获得团头鲂核因子κB抑制蛋白β(MaIκB-β)可溶性蛋白,以及MaIrf1和MaIrf2不可溶蛋白,并对其进行抗菌性试验,结果显示获得的MaIκB-β可溶性蛋白在体外试验中并没有抗菌作用,但Western-Blot(WB)和Immuno-Fluorescence(IF)试验结果显示在嗜水气单胞菌感染的过程中,干扰素调节因子与炎症因子都参与了抗菌免疫应答。3.通过构建真核表达质粒,在鲤EPC细胞研究了团头鲂4个Matlrs在信号传导过程中功能的相似性及差异性,利用GFP融合蛋白对其进行亚细胞定位,激光共聚焦结果显示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21蛋白质都位于细胞质中,其中MaTlr5a和MaTlr5b与早期内涵体和晚期内涵体位于不同位置,而MaTlr9和MaTlr21与早期内涵体和晚期内涵体都位于同一位置。利用过表达载体研究Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21全长基因对干扰素相关免疫因子的转录调控,结果表明其均能诱导irf3、irf7、isg15、mx1、pkr和viperin的上调,说明团头鲂4个Matlrs的信号传导过程是相似的,但是其上调的时间与上调基因表达量的程度是不同的,对viperin、isg15和irf7上调程度较高,pkr上调程度最小,而且Matlr5b最先调控干扰素通路,可能发挥主要功能,Matlr21最后调控,可能在信号传导过程中发挥辅助作用。因此它们在执行功能中可能有差异,但是都能够参与机体抗病原体的免疫应答。4.利用克隆方法获得6个Mairfs启动子序列,序列分析发现其启动子序列中都有核转录因子κB(NF-κB)位点。利用双荧光素酶报告试验探究了Matlrs对Mairfs启动子的调控关系,而且在人类293T细胞和鲤EPC细胞这两种细胞系中得到的结果相似,说明此信号传递的过程不受物种限制。双荧光素酶报告试验结果显示团头鲂Matlr5a和Matlr9能够促进Mairf7启动子活性,但是不能促进其他基因的启动子活性;Mairf5b能够促进Mairf1和Mairf7启动子的活性,而Matlr21并不能促进任何Mairfs启动子活性,说明Matlrs对Mairfs启动子的调控较为复杂。利用细胞凋亡试验研究过表达Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21后,在细菌感染细胞过程中对细胞凋亡的调控,试验结果显示MaTlr5a,MaTlr9和MaTlr21都能够在一定程度上抑制了细胞凋亡,而MaTlr5b在一定程度上促进了细胞凋亡。综上所述,在团头鲂Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21以及Mairf1、Mairf2、Mairf3、Mairf4a、Mairf4b、Mairf5、Mairf6、Mairf7、Mairf8、Mairf9和Mairf10在抵抗嗜水气单胞菌感染过程中能够调控机体免疫,通过二者的相互作用,能够更好的保护机体免受病原体的入侵,但是Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21在信号传导及行使功能过程中具有一定的差异,这为进一步探究鱼类Tlr及Irf信号通路在抗细菌过程中的调控奠定基础。