目的：　　肺癌是近二十年来世界上发病率、死亡率增长最快的恶性肿瘤，据统计，在欧美发达国家和我国大城市中，肺癌已位居男性恶性肿瘤发病率、死亡率的首位，女性恶性肿瘤发病率的第二位，死亡率的第一位，且目前仍呈不断上升的趋势。由于肺癌起病隐匿，早期缺乏特异性诊断手段，而且易发生侵袭转移，是导致肺癌治疗失败的主要原因，因此探讨影响肺癌发生的机制，尽早给予干预治疗，抑制肿瘤的生长及转移的发生就成为研究的重点。　　最近发现研究发现泛素——蛋白酶体途径与癌相关性脱调控有关，参与癌性转化、肿瘤进展、免疫监控逃逸及抗药性等真核细胞的许多代谢过程。因此，这种途径可能是肿瘤异常调节机制的重要靶点。小泛素相关修饰蛋白(SUMO)是一种类泛素蛋白，广泛存在于真核生物中，与泛素化靶向降解蛋白质不同，SUMO化修饰参与了更为广泛的细胞内代谢途径，在调控蛋白质的稳定性，蛋白-蛋白之间的相互作用，转录活性及细胞定位等方面发挥者重要作用。近年来研究发现多种转录因子和转录辅助因子均能被SUMO化，其中包括与肿瘤关系密切的转录因子c-Jun，P53，组蛋白脱乙酰酶HDACs，说明这种翻译后修饰在基因的转录调控中起非常重要的作用，表明与肿瘤的发生密切相关。　　SUMO共价连接到靶蛋白上需要一系列酶的级联反应，其中SUMO唯一的接合酶E2—Ubc9可以识别特异的靶蛋白位点，在SUMO化修饰中起重要作用。有研究表明，Ubc9在许多肿瘤组织中高表达，例如，通过基因微阵列分析发现Ubc9在肺腺癌组织中过表达，通过半定量RT-PCR及免疫组化研究发现Ubc9在卵巢癌上皮组织中过表达，而且Ubc9在人黑色素细胞瘤的转移淋巴结中高表达，最新的研究表明在乳腺癌细胞MCF-7中Ubc9可以诱导凋亡因子Bcl-2表达，从而解释了异位表达的Ubc9可以促进肿瘤的增殖，这些结果提示Ubc9与肿瘤的增殖和调亡相关，可能成为肿瘤治疗的靶目标。但是Ubc9在肺癌中的表达情况及其具体的作用目前报道甚少，Ubc9是否影响肿瘤细胞的其他特性，如侵袭和转移的能力，目前相关研究甚少。本研究探讨了Ubc9是否可以影响肺癌细胞的侵袭性。　　基于此，本研究拟首先探明Ubc9在临床肺癌病理组织中的表达情况，明确其可能的临床意义，进一步采用基因转染的方法，利用真核表达载体，对Ubc9基因在人肺癌细胞NCI-H446中的高表达所产生的肿瘤特性的改变进行了研究。通过将稳定转染Ubc9基因的肺癌NCI-H446接种于裸鼠，观察Ubc9基因对肺癌细胞的体内成瘤性及转移性的影响，进一步明确Ubc9与肺癌发生、发展的关系。　　方法：　　1、免疫组织化学法观察人临床肺癌标本中Ubc9的表达情况　　2、实时定量PCR(Real time quantitative PCR，RT-qPCR)检测人肺癌组织中Ubc9的mRNA表达水平　　(1)提取肺癌组织中总RNA　　(2)根据人Ubc9和GAPDH基因的基因序列（Genebank登录号分别为:NM_003345和NM_002046），按Beacon Designer3.0软件设计二者的引物　　(3)标准品质粒(pUCmT-Ubc9和pUCmT-GAPDH)的构建　　①以人肺癌组织cDNA为模板，PCR扩增Ubc9、GAPDH基因片段　　②按照DNA凝胶回收试剂盒(V-gene)说明书进行PCR产物回收　　③PCR产物和载体pUCmT的连接　　④感受态细菌的制备、重组质粒的转化、筛选和鉴定　　⑤重组质粒的测序鉴定　　(4)采用ExScriptTMRT-PCR Kit合成肺癌组织的cDNA　　(5)实时定量PCR采用SybrGreen法，以GAPDH为内参照，进行双标准曲线法进行相对定量。　　3、RT-PCR检测不同肺癌细胞株中Ubc9 mRNA表达情况　　4、蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测不同肺癌细胞株中Ubc9表达情况　　5、肿瘤细胞侵袭试验分析不同肺癌细胞株的侵袭迁移能力　　6、建立稳定表达Ubc9蛋白的肺癌细胞NCI-H446细胞，观察其粘附和侵袭能力的改变　　(1)提取Invitrogen公司载体pEGFP-N1质粒DNA，双酶切回收酶切产物　　(2)根据Ubc9基因的基因序列，考虑定向克隆的需要，分别设计带有接头序列的上游引物和下游引物，从NCI-H446细胞DNA中利用PCR技术扩增Ubc9基因ORF　　(3)将Ubc9基因ORF定向克隆至pEGFP-N1，命名为pEGFPN1-Ubc9　　(4)通过在多克隆位点两端进行测序，验证pEGFPN1-Ubc9读码框的正确性　　(5)利用无内毒素型超纯质粒DNA中量制备试剂盒，提取无内毒素型质粒DNA，准备转染　　(6)利用Fugene TM6 transfection reagent，对NCI-H446细胞进行转染，通过10-14天的G418筛选，挑取单克隆，扩大培养，形成能够稳定传代的细胞克隆株　　(7)利用Ubc9的抗体，用Western blot方法检测Ubc9-EGFP融合蛋白的表达，以此来鉴定转染成功的单克隆细胞株;荧光显微镜观察活细胞中Ubc9-EGFPP融合蛋白的表达　　(8)利用肿瘤细胞粘附试验和侵袭迁移试验观察转染后的NCI-H446细胞的粘附和侵袭迁移能力的改变　　7、观察稳定转染Ubc9基因的NCI-H446肺癌细胞在动物体内成瘤性及迁移性的变化　　(1)扩大培养转染了Ubc9基因的NCI-H446肺癌细胞克隆株　　(2)经左心室途径将肺癌细胞接种给裸鼠，接种癌细胞的小鼠按分组饲养，标注接种日期。　　(3)转移瘤的检测　　①接种四周后，处死动物后，体外行预冷的4％多聚甲醛灌注固定，观察动物体内肺、肝、及腹腔等器官成瘤情况　　②利用HE染色观察形成肿瘤的形态　　结果：　　1、免疫组织化学染色结果表明:在小细胞肺癌、肺鳞癌和肺腺癌中均有Ubc9阳性表达，用Image-pro Plus6.0图像分析软件对免疫组化的结果进行定量分析，结果同样发现Ubc9在肺癌组织中的表达水平明显高于非癌变的肺组织，并且在非小细胞癌中的表达水平高于小细胞癌，有统计学差异(P＜0.05)。68(68％)例Ubc9高表达的肺癌患者淋巴结转移数目为9±2.33，而32(32％)例Ubc9低表达的肺癌患者淋巴结转移数目为3±3.54，做完全随机资料的方差分析，二者差异性显著(P＜0.05)。　　2、Real-time PCR检测了人肺癌不同病理组织类型和非癌变肺组织中Ubc9mRNA表达，结果表明，Ubc9 mRNA在非癌变肺组织及发生癌变的肺组织中均有表达，但其表达水平存在明显的差异性，并且在不同的组织类型中也存在表达差异:Real-time PCR结果显示肺癌组织中Ubc9mRNA表达水平高于非癌变肺组织，非小细胞肺癌组织中的表达水平高于小细胞肺癌组织，有统计学差异(P＜0.05)　　3、利用RT-PCR和western blot试验分析了不同肺癌细胞株中Ubc9的表达水平，并与其肿瘤细胞侵袭迁移试验结果进行对比分析，结果发现小细胞肺癌细胞NCI-H446的侵袭迁移能力明显低于其他的肺癌细胞株，而且试验结果提示细胞中Ubc9的表达水平高，则该细胞的侵袭迁移能力相对强。　　4、成功构建真核表达载体pEGFPN1-Ubc9，利用Invitrogen公司的真核表达载体pEGFPN1，构建了真核表达载体pEGFPN1-Ubc9，使得所表达融合蛋白的N-末端连接有EGFP，可以为下一步的利用荧光显微镜观察提供方便。　　5、得到稳定表达Ubc9基因的NCI-H446肺癌细胞克隆株。　　6、Ubc9基因的外源性表达可以促进NCI-H446肺癌细胞的侵袭迁移能力及细胞粘附能力。　　7、转染Ubc9基因的NCI-H446肺癌细胞在动物体内成瘤性及迁移性的变化　　(1)经左心室途径将NCI-H446肺癌细胞接种给裸鼠，大约四周左右可以在裸鼠的肺内观察到大小不等、散在分布的肿瘤结节。　　(2)将稳定表达Ubc9基因的NCI-H446肺癌细胞克隆株扩大培养后经左心室途径接种给裸鼠，明显缩短了裸鼠肺内肿瘤形成的时间（最早可以两周左右在肺内看到肿瘤结节），且肿瘤结节数目明显增加。同时出现肺外器官的转移瘤，在肝脏和腹腔内均有肿瘤结节出现。　　(3)利用HE染色观察肿瘤结节的组织形态学情况，可见转染Ubc9的NCI-H446的细胞在肺内形成典型的小细胞肺癌细胞的实体肿块，具有小细胞肺癌细胞的病理特点:细胞呈淋巴细胞状，核大，胞浆少，形似裸核。由于核大，小细胞肺癌细胞几乎都呈深蓝色，聚集成灶　　结论：　　1、Ubc9在肺癌组织中的表达水平较非癌变肺组织明显增高，并且在非小细胞肺癌中的表达水平高于小细胞肺癌;与肺癌的淋巴结转移程度具有一定的相关性。Ubc9表达水平可能与在肺癌细胞的侵袭迁移能力有关。　　2、获得了Ubc9基因稳定转染的人小细胞肺癌细胞NCI-H446细胞克隆，从而可以在细胞和分子水平研究Ubc9基因的功能。Ubc9基因在NCI-H446细胞中的外源性表达可以增强NCI-H446细胞的粘附能力及侵袭迁移能力。　　3、表达外源性Ubc9的肺癌细胞NCI-H446细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力增强，发生转移的能力明显增强，说明Ubc9可以影响体内肺癌细胞的成瘤性和转移性。